基因工程试题及答案全集

2021年2月28日发(作者：夏霓)

基因工程试题及答案全集


作业一：

一、名词解释：

1
、基因：是遗传的物质基础，是
DNA
（脱氧核糖核酸）分子
上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，
是具有遗传效应
的< br>DNA
分子片段。

2
、基因组该指单倍体细胞中包括编码序列和非编 码序列在内
的全部
DNA
分子

3
、操纵子
:原核生物的几个功能相关的结构基因往往排列在
一起，转录生成一个
mRNA
，然 后分别翻译成几种不同的蛋
白质。
这些蛋白可能是催化某一代谢过程的酶，
或共同完成
某种功能。
这些结构基因与其上游的启动子，
操纵基因共同
构成转录单位，称 操纵子。

4
、启动子
:
是
RNA
聚合酶结合位点 周围的一组转录控制组件，
包括至少一个转录起始点。
在真核基因中增强子和启动子常
交错覆盖或连续。
有时，
将结构密切联系而无法区分的启动
子、增强子样结构统称启动 子。

5
、增强子
:
是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早
是在
SV40
病毒中发现的长约
200bp
的一段
DNA< br>，可使旁侧
的基因转录提高
100
倍，
其后在多种真核生物，
甚至在原核
生物中都发现了增强子。增强子通常占
100
～
200bp
长度，
也和启动子一样由若干组件构成，
基本核心组件常为
8
～
1 2
bp
，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。


6
、基因 表达：是指细胞在生命过程中，把储存在
DNA
顺序中
遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分
子。

二、简答题

1
、说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。

答：限制性内切核酸酶采用三 字母的命名原则
,
即属名
+
种名
+
株名的各一个首字母,
再加上序号
.
基本原则
: 3-4
个字母组
成,
方式是
:
属名
+
种名
+
株名
+序号
;
首字母
:
取属名的第一
个字母
,
且斜体大写
;
第二字母
:
取种名的第一个字母
,
斜体
小写
;
第三字母
: ( 1)
取种名的第二个字母
,
斜体小写
;(2)
若种
名有词头
,
且已命名过限制酶
,
则取词头后的第一字母代替
.
第四字 母
:
若有株名
,
株名则作为第四字母
,
是否大小写
,
根
据原来的情况而定
,
但用正体
.
顺序号
:
若在同一菌株中分
离了几种限制酶
,
则按先后顺序冠以
I,
Ⅱ
,
Ⅲ
,
…

等
,
用正体
.
2
、什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素影向？

答：Ⅱ类限制 酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是
这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出
来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别

的序列和切割都有一些改 变，改变后的活性通常称第二活性，
而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个
星号表示，因此第二活性又称为星号活性。





概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：

(1)
高甘油含量
(>5
％
,
v
／
v)
；

(2)
限制性内切核酸酶用量过高
(>100U
／
ugDNA)
；

(3)
低离子强度
(<25
mmol
／
L)
；

(4)
高
pH(8 .0
以上
)
；
(5)
含有有机溶剂，如
DMSO
， 乙醇等；

(6)
有非
Mg2+
的二价阳离子存在
(如
Mn2+
，
Cu2+
，
C02+
，
Zn2+
等
)
。

3
、影响
DNA
连接酶催化连接反应的因素有哪些？

答：（
1
）
DNA
的纯度

（
2
）
DNA
甲基化的程度

（
3
）酶切消
化反应的温度

（
4
）
DNA
的分子结构

（
5
）核酸内切限制酶的
缓冲液

4
、什么是Klenow
酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作
用？


答：
Klenow
酶是
1974
年
Klenow
用枯草杆菌 蛋白酶水解
DNA
聚合酶
I
，得到两个片段，其中大片段的分子量为
75kDa
，它
具有
5'-3'
聚合酶和
3'-5'
外切核 酸酶的活性，小片段具有
5'-3'
外切核酸酶活性。由于大片段失去了
DNA
聚合酶
I
中会
降解
5'
引物的
5'-3'
外切核 酸酶的活性，所以在基因工程中
更有用。

Klenow
酶主要有下列用途：

(1)
修复反应，制备平末端


可用
Klenow
酶 修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的
5'
或
3'
突出末端，制备平末端， 这样可以使原来具有不相容
的黏性末端的
DNA
片段通过平末端重组。如在反应系统中 加
入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法
可以制备
3'
末 端标记的探针。


用
Klenow
酶修复
5'
突出末端的反应主要是利用了
Klenow
酶的
DNA
聚合酶活性，是填补 反应；而修复
3'
突出末端则是
用
Klenow
酶的
3'- 5'
外切核酸酶的活性，是切割反应。用

Klenow
酶的切割反应来修复
3'
突出末端是不理想的，改用
T4DNA
聚合酶或其他的酶是更好的选择。

(2)
标记
DNA3'
突出末端
(protruding end)

该反应分两步进行：先用
3'-5'
的外切核酸酶活性除去
3'
突出 末端，产生
3'
隐含末端，然后在高浓度的标记底物
( -32p-dNTP)
存在下，使降解
(3'-5')
作用与聚合
(5'-3')
作
用达 到平衡。这种反应也叫交换或取代反应
(exchange
／
replacement reaction)
。不过这一反应用
T4DNA
聚合酶的效
果更好，因它的
3'-5'
外切核酸酶活性较强。

(3)
其他的一些用途： 包括用双脱氧末端终止法进行
DNA
序列分析、用于
cDNA
第二链的合成、 在定点突变中用于合成
第二链、用引物延伸法
(primer extension)
制备单链
DNA
探
针等。

5
、细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同？在
基因工程中有什么用途？

答：主要差别是：
CIP68
°
C
时失活，而
BAP68
°
C
稳定，且耐
酚抽提。应用：


(1)dsDN A
的
5'
端脱磷酸，防止
DNA
的自身连接。但是用
CIP
处理后，最好将
CIP
除去后，再进行连接反应。

(2)D NA
和
RNA
脱磷酸，
然后用于多核苷酸激酶进行末端标
记。

三、论述题

1
、如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序 列
组成，可以通过何种方法克隆该基因
?
答：可以通过合成核苷酸探针或设计简并< br>PCR
引物从
cDNA
文
库或基因组文库中筛选。或者利用相应的抗体 从
cDNA
表达文
库中筛选相应的克隆。

作业二：

一、名词解释：

1
、基因工程：在体外将外源基因进行切割并与一定的载体 连
接，构成重组
DNA
分子并导入相应受体细胞，使外源基因在
受体细胞中进 行复制、表达，使目的基因大量扩增或得到相
应基因的表达产物或进行定向改造生物性状。

简单概括，就
是将外源目的基因与载体重组后再进入宿主细胞的过程。

2< br>、载体：能载带微量物质共同参与某种化学或物理过程的常
量物质，在基因工程重组
DN A
技术中将
DNA
片段（目的基因）
转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA
分子。三种最常用
的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。

3
、
转化：
指将质粒或其他外源
DNA
导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程。

4
、感染：利用噬菌体将外源
DNA
导入宿主细胞的方法。


5
、
转导：
由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。< br>它是细菌之间传

递遗传物质的方式之一。
其具体含义是指一个细胞的
DNA
或
R
NA
通过病毒载体的

感染转移到另一个细胞中。

6
、转染：指真核细胞主动摄取或被动导入外源
DNA
片段而获
得新的表型的过程。常用的方法有电穿孔法，磷酸钙共沉淀
法 ，脂质体融合法等。

二、简答题

1
、
YAC
载 体具有什么样的功能性
DNA
序列？为什么在克隆大
片段时，
YAC
具有优越性？

答：
YAC
带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒 ，
一个
DNA
复制起点，两个端粒。
YAC
能够容纳长达几百
kb
的外源
DNA
，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更
有可能包含 完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的
步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。

2
、列举质粒载体必须具备的
4
个基本特性。


答：
(1)
独立复制；
(2)
有选择标记；
(3)
有独特的酶
切位点；
(4)
能转化但不扩散。

3
、
PCR
的基本原理是什么？ 用
PCR
扩增某一基因，必须预先
得到什么样的信息？


答：
)DNA
半保留复制的原理，在体外进行
DNA
的变性、复性
和 引物延伸。

(2)
至少要预先知道足够合成一对引物的靶
DNA
序列。

4
、
cDNA
克隆与基因组克隆有何不同？

答：基因组克隆包含所有不在
cDNA
中出现的内含子。

5
、
怎样将一个平末端
DNA
片段插入到
EcoR
I
限制位点中去？

答：化学合成一些长为
10bp
含有< br>EcoRI
识别位点的短的
DNA
片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果 用
EcoRI
切割
这种连接片段，就会产生
EcoRI
的单链末端。 这种片段就可
以插入到任何
EcoRI
的限制性内切酶位点中。

三、论述题

什么是
Western
印迹？它与
South ern
印迹有什么不同

答：
Western
印迹是将蛋白质经电 泳分离后从凝胶中转移到
固相支持物上，
然后用特异性的抗体进行检测。
它与
Southern
的不同在于探针的性质不同，在
Western
印迹中使用的探针< br>是抗体
(
蛋白质
)
。

作业三：

一、名词解释

1
、
DNA
变性：
DNA
分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线
性结构的现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。


2
、
DNA
复性：变性
DNA
在适当条件下
,< br>二条互补链全部或部
分恢复到天然双螺旋结构的现象
,
它是变性的一种逆转过程 。

3
、退火：指模板双链
DNA
经热变性，螺旋解开成单链后，通
过缓慢冷却到
55
℃左右，
使引物
(
即具有互补碱基的RNA
片段
)
与该模板
DNA
单链重新配对，形成新的双链分子 的过程。

4
、
DNA
芯片：是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸 或者直
接将大量的
DNA
探针以显微打印的方式有序地固化于支持物
表面，然 后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，
即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作 为固相
支持物，所以称为
DNA
芯片。

5
、错义突变：碱基替换的结果引起氨基酸顺序的变化。

6
、基因 诊断：又称
DNA
诊断或分子诊断，通过分子生物学和
分子遗传学的技术，直接检测出 分子结构水平和表达水平是
否异常，从而对疾病做出判断。

二、简答题

1
、什么是蓝白斑筛选法？

答：这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组 体。主要是
在
?
载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌
?
—半乳糖苷 酶的
基因片段，
携带有
lac
基因片段的
?
载体转入
lac
的宿主菌后，
在含有
5
—溴—
4
—氯—
3
—引哚—
?
—
D
—半乳糖苷
(X-gal)
平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插人
lac(
或
lac
基因部
分被取代
)
后，重组的噬菌体将丧失分解
X-gal
的能力，转入
-
lac
宿主菌后，在含有
5
—溴—
4
—氯—
3< br>—引哚—
?
—
D
—半乳

糖苷
(X-gal)
平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则
为蓝色噬菌斑。

2
、什么是基因文库？

用重组
DNA
技术将某种生物细胞的总
DNA
或染色体
D NA
的所
有片断随机地连接到基因载体上
,
然后转移到适当的宿主细
胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），
在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全 部基因都包含在
内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文
库。
3
、黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但
是也有一些不足，请指出这些 不足之处。

答：黏性末端连接法不足之处有：
(1)
载体易自身环化；(2)
若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易
定向克隆；
(3 )
难插入特定的基因；
(4)
再者就是大片段
DNA
的重组率较低， 即使用碱性磷酸酶处理了载体，防止了载体
的自身环化，载体也有成环的倾向；
(5)
用这种方法产生的重
组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的
串联重组体，增 加筛选工作的困难。

4
、什么是同聚物加尾连接法？用何种方法加尾？具有哪些优
缺点？

答：所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双
链
DNA
的
3< br>’端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，
外源
DNA
和载体
D NA
分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如
dA(dG)
和
dT(dC),< br>然后在
DNA
连接酶的作用下涟接成为重组的
DNA
。这种方法的核心 是利用末端转移酶的功能，将核苷酸转
移到双链
DNA
分子的突出或隐蔽的
3 '-OH
上。
以
Mg
2+
作为辅助
因子，该酶可以在突出的
3'-OH
端逐个添加单核苷酸，如果

用
Co
作辅助因子 则可在隐蔽的或平末端的
3'-OH
端逐个添加
单个核苷酸。


同聚物加尾法实际上是一种人工黏性末端连接法，具有很
多优点：
．
(1)< br>首先不易自身环化，这是因为同一种
DNA
的
两端的尾巴是相同的，所以不存在 自身环化。
(2)
因为载体
和外源片段的末端是互补的黏性末端，所以连接效率较高。
(3)
用任何一种方法制备的
DNA
都可以用这种方法进行连
接。同 聚物加尾法也有一些不便之处：
(1)
方法繁琐；
(2)
外源片段难以回收。 由于添加了许多同聚物的尾巴，可能
会影响外源基因的表达。另外要注意的是，同聚物加尾法
同 平末端连接法一样，重组连接后往往会产生某种限制性
内切核酸酶的切点。

5
、何谓接头连接法？

答：将人工合成的或来源于现有质粒的一小段
DNA
分子
(
在这
一小段
DNA
分子上有某种限制性内切 核酸酶的识别序列
)
，加
到载体或外源
DNA
的分子上，这样便在载 体
DNA
和外源
DNA
上制造出新的酶切点。把这一小段含有酶切点的
DNA
分子称
为连接器分子，这种方法称为接头连接法。

三、论述题

1
、什么是基因组文库
(genomic libra ry)?
构建基因组文库，
涉及哪些基本过程
?
它同遗传学上的基因库有什么 不同
?
答：基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一
生物基因组
DNA
的各种片段

的克隆群。一般以改造的噬菌
体
DNA< br>或黏粒作为载体，包括下列过程：
(1)
高分子量染色体
DNA
的制备 ；
(2)
体外重组连接；
(3)
包装蛋白的制备；
(4)
重
组体的体外包装；
(5)
将重组
DNA
导人寄主细胞；
(6 )
筛选。
2+

基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基
因库
(gene pool )
是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行
生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构 建中，由
于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因
组文库、
YAC< br>文库、
BAC
文库等。

作业四：

一、名词解释

1
、
DNA
重组：是由于不同
D NA
链的断裂和连接而产生
DNA
片
段的交换和重新组合，形成新
D NA
分子的过程。

2
、克隆：科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克 隆，这
门生物技术叫克隆技术，其本身的含义是无性繁殖，即由同
一个祖先细胞分裂繁殖而形成 的纯细胞系，该细胞系中每个
细胞的基因彼此相同。

3
、
DNA
克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物
质——同源或异源、原核或真核、天然或人 工的
DNA
与载体
DNA
相结合成一具有自我复制能力的
DNA分子——复制子，
继
而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子
细 胞，再进行扩增、提取获得大量同一
DNA
分子，即
DNA
克
隆。< br>
4
、目的基因：把需要研究的基因称为目的基因。
（一般把需
要分 析的基因称靶基因，在基因克隆过程中有时两者均称为
插入基因，有时三者含义相近。
）

5
、基因载体：基因载体是把基因导入细胞的工具，他的作用

是①运载目的基因进入宿主细胞，②使之能得到复制和进行
表达。

6、质粒：质粒（
plasmid
）是细菌拟核裸露
DNA
外的遗传物质，为双股闭合环形的
DNA,
存在于细胞质中，质粒编码非细
菌生命所必须的某 些生物学性状，如性菌毛、细菌素、毒素
和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。

二、简答题
1
、常用的工具酶有哪些？其主要用途是什么？

答：限制性内切核酸酶
, DNA
聚合酶和
Klenow
大片段
,DNA
连
接酶
,
碱性磷酸酶
,
末端脱氧核苷酸转移酶
.
限制性内切核酸
酶
,
能够识别特异的
DNA
碱基序列，
DNA
碱基序列往往呈回
文对称结构；
DNA
聚合酶
a
位于细胞核内，也许是复合物，
有催化细胞增生的作用；
Klenow
大片段它也可以通过基因工
程得到，
分子量为
76kDa
。
DNA
连接酶负责双链
DNA
中相邻
3`-OH
与
5`-
磷酸基团之间的磷酸二酯键的形成。

碱性磷酸
酯酶的作 用是从
DNA
或
RNA
的三磷酸核苷酸上除去
5`
磷酸根< br>残基。

末端转移酶的作用是将脱氧核糖核苷酸通过磷酸二酯
键加到
D NA
分子的
3`-OH
末端。

2
、重组
DNA
技术常包括哪些基本步骤？

答：
①获得目的基因；

②与克隆载体连接，
形成新的重组
DNA
分子；

③用重组
DNA
分子转化受体细胞，并能在受体细胞中
复制和遗传；

④对转化子筛选和鉴定。在具体工作中选择哪
条技术路线；

⑤对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，

获得所需的遗传性状或表达出所需要的 产物。主要取决于基
因的来源、基因本身的性质和该项遗传工程的目的。

3
、常用的目的基因的获取方法有哪些？

答：

直接获 取从基因文库中提取目的基因，使用
PCR
扩增技
术获得目的基因
;
人工合成
.
4
、常用的目的基因与载体的连接方法有哪些？

答：外源
DNA
片段同载体分子连接的方法，即
DNA
分子体外重组技术，主要是依赖于核酸内切限制酶和
DNA
连接酶的作
用．一般说来在选择 外源
DNA
同载体分子连接反应程序时，
需要考虑到下列三个因素：

（
1
）实验步骤要尽可能地简单
易行；

（
2）连接形成的

接点”序列，应能被一定的核酸内
切限制酶重新切割，以便回收插入 的外源
DNA
片段；

（
3
）
对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。

5
、解释质粒，为什么质粒可作为基因载体。

答：质粒是细菌拟核裸露
DNA
外的遗传物质。

质粒：
（
1
）具
有较小的分子量。经验表明，为了避免在
DNA
的纯化过程中
发生链的断裂，克隆载体的分子大小最好不要超过
10Kb
。
pBR322< br>质粒这种小分子量的特点，
不仅易于自身
DNA
的纯化，
而且可容纳较 大的外源
DNA
片段；

（
2
）具有两种抗菌素抗
性基因可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组
DNA
分
子是否进入宿主细胞以及 外源
DNA
分子是否插入载体分子形
成了重组子。

三、论述题
1
、何谓限制性核酸内切酶？写出大多数限制性

核酸内切酶识
DNA
序列的结构特点。

答：限制性核酸内切 酶是一类能识别双链
DNA
分子中特异性
核苷酸序列并由此特异切割
DNA< br>双链结构的水解酶
.
是在
DNA
分子内部切割，水解磷酸二酯键的核 酸内切酶。能够识别特
异的
DNA
碱基序列，
DNA
碱基序列往往呈回文对称结构；并
具有特异切割位点。

作业五：

一、名词解释

1
、限制性核酸内切酶：是由细 菌产生的一类能特异识别双链
DNA
中的特定碱基序列，
并在识别位点切割磷酸二酯键 的核酸
内切酶
(
简称限制酶
)
。

2
、 基因文库：将所有的重组
DNA
分子都导入宿主细胞进行扩
增，得到分子克隆的混合体 ，这样一个混合体称为基因文库。

3
、
cDNA
文库：从组织细 胞中分离得到纯化的
mRNA
，然后以
mRNA
为模板，利用逆转录酶合成其 互补
DNA
，再复制成双链
cDNA
片段，
与适当载体连接后导入受 体菌内，
扩增，
构建
cDNA
文库。

4
、RFLP
：
RFLP
标记是发展最早的
DNA
标记技术。
RFLP
是指
基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶
切位点上碱 基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。

5
、核酸探针：是指与特定的靶分子发 生特异性相互作用，并
可被特殊的方法探知的分子。抗体
-
抗原、生物素
-< br>抗生物素
蛋白、生长因子
-
受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子

的相互作用。

6
、转录：转录是遗传信息由
DNA
转换 到
RNA
的过程。作为蛋
白质生物合成的第一步，
转录是
mRNA< br>以及非编码
RNA
（
tRNA
、
rRNA
等）的合成 步骤。

二、简答题：
1
、试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的
因素？

答：外因：是可以预见 的，如反应条件（缓冲液、反应温度、
反应时间、终止酶切的方法）
、底物的纯度（是否有杂质 、是
否有盐酚的污染）
、
何时加酶、
操作是否恰当、
反应体积等等< br>;
内因：星星活性、末端长度、位点偏爱、甲基化底物、底物
的构象。

2
、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？

答：将外源
DNA
或基因携带入宿主细胞（
host cell
）的工具
称为载体

载体具备的特点：①在宿主细胞内必须能够自主复
制
（具备复制原点）
②必须具备合适的酶切位点，
供外源
DNA
片段插入，同时不影响其复制

③有一定的选择标记，用于筛
选

④最好具有较高的拷贝数，便于制备。

3
、什么叫基因工程（
Gene Engineering
），试从理论和技术
两个方面谈谈
Gene Engineering
诞生的基础？

答：基因工程：在体外将核酸分子插入病毒 、质粒或其它载
体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原来没有这
类分子的宿主细胞内 ，而能持续稳定地繁殖。

理论基础：近
几十年来，由于受到分子生物学、分子遗传学发展的影响，

基 因分子生物学的研究取得了前所未有的进步。而这些学科
的综合成就，又为基因工程的诞生奠定了坚实的 理论基础：

①

在
40
年代确定了遗传信息的携带者，即 基因的分子载体
是
DNA
而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题；

②

在
50
年代揭示了
DNA
分子的双螺旋结构模 型和半保留复制机
理，解决了基因的自我复制和传递的问题；

③

在
50
年代末
期和
60
年代，相继提出了

中心法则

和操纵子学说，并成功
地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。< br>
技术基础：①
60
年代
-70
年代，限制性核酸内切酶和< br>DNA
连
接酶解决了对
DNA
分子进行体外的切割和连接；

②基因克隆
载体的出现

③大肠杆菌转化体系的建立

④< br>60
年代发展的琼
脂糖凝胶电泳和
Southern
转移杂交技术对< br>DNA
片段的分离和
检测十分有用。

4
、抗性基因是目前使 用的最广泛的选择标记，常用的抗生素
抗性有哪几种？并举两例说明其原理？

答：氨苄青霉素抗性基因
ampr
、

四环素抗性基因
tetr
、氯
霉素抗性基因
Cmr
、

卡那霉素和新霉素抗性基因
kanr
①氨
苄青霉素抗性基因
ampr:
青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合
成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应
.
氨苄青
霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，
抑制转肽反应并催化
b-
内酰胺环水解
（水解青霉素）
，
从而解
除了氨苄青霉素 的毒性。

②四环素抗性基因
tetr
：

四环素
可与核糖体
30S
亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的

转位。四环素抗性基因编码一个由
399
个氨基酸组成的膜结
合蛋白，可阻止 四环素进入细胞。

5
、
YAC
载体具有什么样的功能性元件？为什么它在克隆大片
段时具有很大的优越性？

答：
YAC
带有天然染色体所有的功能元件，
包括自主复制序列
ARS，一个着丝粒，两个端粒，选择标记，筛选模型。

优越
性：
YAC能够容纳长达几百
Kb
的外源
DNA
，这是质粒和粘粒
办不到的 。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色
体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整 基因
组文库所需的克隆数目。
YAC
有灵活性，
可作为质粒在

中增殖；与大片段连接时，可导入酵母，作为真正染色体在
酵母复制中有丝分裂。

三、论述题
1
、分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶
电泳的异同点？

答：同：① 原理相同。琼脂糖、聚丙烯酰胺均为无反应活性
的稳定支持介质，可降低对流运动，故使电场中的分子电 泳
迁移率仅与分子的摩擦系数成反比。在一定电场强度下，
DNA
分子的迁移率取决于 核酸分子的大小和构象。

②凝胶浓度的
高低影响凝胶介质孔隙大小；浓度越高，空隙 越小，其分辨
能力也就越强；反之，浓度降低，空隙就增大，其分辨能力
也就随之减弱。

异：琼脂糖凝胶分辨
DNA
片段的范围为
-50Kb
之间；而聚 丙烯酰胺分辨
DNA
片段的范围为
1-1000bp
，分离小片段效果最好， 分辨率极高，相差
1bp
的

DNA
也可分开。

分子克隆技术
:
指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外
进行拼接重组，然后转入 另一种生物体（受体）内，使之按
照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的
DNA体外
操作程序，也称为分子克隆技术

克隆：是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上相同
的

DNA
分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体

载体：携带外源
DNA
进入宿主细胞的工具。化学本质：
DNA

1.
运送外源基因高效转入受体细胞
2.
为外源基因提供复制能
力或 整合能力
3.
为外源基因的扩增或表达提供条件。

基因工程的含义：按照预 先设计好的蓝图，利用现代分子生
物学技术，特别是酶学技术，对一种生物（供体）的遗传物
质 （
DNA
）直接进行体外重组操作与改造，并转移到另外一
种生物（受体）中去，从 而实现受体生物的定向改造与改良。


黏性末端是指
DNA
分子在 限制酶的作用之下形成的具有互补
碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对
而 重新环化起来

DNA
连杆，
是指用化学方法合成的一段由
10～
12
个核苷酸组
成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。

DNA
接头

它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切
酶 粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。当
它的平末端与平末端的外源
DNA片段连接之后，
便会使后者
成为具黏性末端的新的
DNA
分子，而易于连 接重组。


载体：携带外源
DNA
进入宿主细胞，并为其提供复制 和功能
基因表达调控系统的工具。

目的基因：基因工程中克隆的目标
DNA
分子

SD
序列：
mRNA
中起始密码子上游
8-13
个核苷酸处有一段
富含嘌呤核苷 酸的顺序，
它可以与
30S
亚基中的
16S rRNA 3’
端富含 嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，有助于
mRNA
的翻
译从起始密码子处开始

启动子：
DNA
分子与
RNA
聚合酶特异结合的部位，也是转
录开始的部位

基因组文库：某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载
体贮存在 一个受体菌的群体之中，这个群体即为该生物的基
因组文库。

cDNA
：以
mRNA
为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。
< br>cDNA
文库：某种生物基因组转录的的全部
mRNA
经反转录
产生的 各种
cDNA
分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌
的群体中，这个群体就称为cDNA
文库。

转化：
受体菌直接吸收供体菌的
DNA
片断而获得后者部分遗
传性状的现象。

转化子（
transforman t
）
：通过转化方式而形成的杂种后代。

感受态：
指受体细胞最易 接受外源
DNA
片断并能实现转化的
一种生理状态。

转染：将重组λ
DNA
分子直接导入受体细胞的过程。

转导：
通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源
DNA
分

子转移到受体细胞内的过程

重组子的筛选：经过各种方法将外源
DNA分子导入受体，获
得所需目的重组子的过程

选择：转化子的初步筛选：通过某种 外加压力（如：抗生素）
的辨别作用，
呈现具有重组
DNA
分子的特定克隆子 的一种方
法。

筛选：进一步检测目的重组子：通过某种特定的方法，从受
体 细胞群体或基因文库中，鉴定出目的重组子的过程。

启动子：
DNA
链上一 段能与
RNA
聚合酶结合并能起始
mRNA
合成的序列

SD
序列：核糖体结合位点

终止子：
在一个基因的
3’
端或是一个操纵子的
3 ’
端 往往还有
一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一
DNA
序列
称为转 录终止子

融合蛋白：
是指蛋白质的
N
末端由原核
DNA< br>序列或其他
DNA
序列编码，
C
端由真核
DNA
的完 整序列编码。

转染：将重组λ
DNA
分子直接导入受体细胞的过程。

转导：通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源
DNA
分
子转移到受体细胞内的过程

重组子：含有重组
DNA
分子的转化子

转化子：导入外源
DNA
分子后稳定存在的受体细胞




供体、受体、载体是
DNA
重组技术的三大基本元件

D NA
体外重组的基本步骤
1.
目的基因的获取：从复杂的生物
基因组中，经过 酶切消化或
PCR
扩增等步骤，分离出带有目
的基因的
DNA
片断。

2.
重组体的制备：将目的基因的
DNA
片断插入到能自我复制并 带有选择性标记的载体分子上

。
3.
重组体的转化：将重组体（载体）转入 适当的受体细胞中。
4.
克隆鉴定：筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）
5.< br>目
的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要
的基因产物。

基因工程的基本操作步骤：
1.
目的基因的获取


从复 杂的生
物基因组中，经过酶切消化或
PCR
扩增等步骤，分离出带有
目的基因 的
DNA
片断。

2.
重组体的制备


将目的基因的
DNA
片断插入到能自我复制并带有选择性标记。

3.
重组体的
转化

将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。
4.
克隆鉴定


筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）
5.
目的基因表达


使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物



载体应具备的条件：

1.
具有对受体细胞的可转移
2.
具 有与特
定受体细胞相适应的复制位点或整合位点
3.
长度尽可能小，
以提高其 载装能力
4.
具有多种单一的酶切位点
5.
具有合适的
选择性标记。

限制性内切酶的命名原则


前
3
个字母代表来 源的生物
,
随后
1
个字母或阿拉伯数字代表菌株
,
最后1
个罗马字母代表发现
或鉴定的次序




star activity
高浓度的酶
（
>100U/
g
）
、
高浓度的甘油
（
>5%
）
、
低离子强度（<25mM
）
、极端
pH
值
(>pH8.0)
等，会使 一些核
酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的
star
activity
现象
.
抑制
star activity
的措施


①

减少酶的用量，避免过量酶切，
减少甘油浓度

②

保证反应体系中无有机溶济或乙醇③

提
高离子强度到
100
～
150mM

④

降低反应
pH
至
pH7.0
⑤

使用
Mg2+
作为二价阳离子


DNA
连接酶

需要在一条
DNA
链的
3
’
-
末端具有一个游离
的羟基
(-OH)
，和在另一条
DN A
链的
5
’
-
末端具有一个磷酸
基团
(-P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接
DNA
分子的
功能作用。

体外连接
DNA
片段的方式

黏性末端

同种内切 酶产生的黏性
末端的连接，同尾酶产生的黏性末端的连接，不同黏性末端
的连接。


平末端的直接连接，末端修饰后的连接，加上连
杆
（

linker
）
，
使之形成黏性末端后，
再用
DNA连接酶连接，
DNA
接头
(adapter)
连接法。

平末端
DNA
片段的连接

（
1
）直接用
T4DNA
连接酶连接；
（
2
）先用末端核苷酸转移酶，给平末端
D NA
分子加上同聚
物尾巴之后再用
DNA
连接酶进行连接；
（
3
）用连杆连接平末
端
DNA
分子；
（
4
）DNA
接头连接法。

载体应具备的条件

1.
具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性
2.
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点
3.
具

有多种单一的酶切位点
4.
具有合适的选择性标记

自我复制表达，外源基因的插入不影响其功能的发挥，易于从宿主细
胞分离出来
5.
分子量尽可能小，以提高其载装能力

质粒
DNA
的复制类型

严谨型质粒

松弛型质粒

天然质粒的缺陷

（
1
）分子量大，拷贝数低

（
2
）筛选标志
不理想

构建质粒克隆载体的基本策略

1
能在受体中进行有效的复制
（有复 制起始位点）
。
2
含多克隆位点
3
含有供选择克隆子的
标记 基因，如：常用的标记基因：
Apr
，
Kmr
，
Smr
，< br>
Tcr
基因等
4
DNA
分子尽可能小和较高的拷贝数。< br>5
根据特殊需
要，组装各种“元件”
，构建不同用途的质粒克隆载体。

质粒克隆载体的构建

1
选择合适的出发质粒
2
正确获得构 建
质粒克隆载体的元件
3
组装合适的选择标记基因
4
选用合适
的启动子
5
构建过程力求简单

DNA
插入而导致基因失活的现象，称之为插入失活效应。

蓝白斑筛选

Ampicillin
抗性和

lacZ< br>的
一个深蓝色的物质
5-
溴
-4-
氯靛蓝

Ti
质粒介导转化的过程


①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着②根癌农杆菌对植物信号物质的感受③根癌农杆菌
Ti
质
粒上的
vi r
基因以及染色体上操纵子的活化④

vir
区基因被激
活，
virD
基因编码的核酸内切酶分别将
T-DNA
的
RB
序列和< br>LB
序列切出单链切口，释放出
T-DNA
的单链线性拷贝，
肽互补（ 蓝白斑）
相结合。
-
半乳糖苷酶能把无色的化合物
Xgal
分解成半 乳糖和

T-DNA
复合体的产生⑤
T-DNA
复合体在
R B
序列的引导下定
向地穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合
到植物的 染色体基因组中

TA
克隆的优点

不需使用含限制酶序列的引物， 不需把
PCR
产物做平端处理，不需在
PCR
扩增产物上加接头，即可直接< br>进行克隆。


TA
克隆注意事项

1.
要获得目的基因的
TA
克隆，
PCR
产物
的特异性要好。
2. PCR
产物在
TA
克隆前要通过纯化。
3.
在
PCR
产物回收、纯化过程中防止外来
DNA
污染。


真核生物的启动子：真核生物有三种类型的
RNA
聚合酶，每
一种 都有对应的启动子。


聚合酶
I
只转录
rRNA
，故只有一种启动子。


聚合酶
II
转录
mRNA
，其启动子最为复杂；


聚合酶
III
转录
tRNA
和
5S
rR NA
，其启动子大都是
位于转录的
DNA
序列之内，称为下游启动子。

目的基因的获得
:
直接分离法
;PCR
扩增
;
构建基因组文库法
;
构建
cDNA
文库法
;
化学合成法
直接分离法
:

限制酶酶切法
(DNA
分子已测序< br>/
目的基因已定
位
)
基因组文库的构建
(DNA
未测序或未定位
)
：

采用限制酶切割

构建基因组文库

筛选目的基因克隆


基因文库构建的一般步骤：

（
1
）染色体
DNA
大片段的制备

①酶切法

②物理切割法

（
2
）载体与基因组
DNA
大片段的连接

①


粘性末端直接连接

②人工接头法

（
3
）转导受体

（
4
）筛选重组子

cDNA
：以
mRNA
为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。
< br>cDNA
文库：某种生物基因组转录的的全部
mRNA
经反转录
产生的 各种
cDNA
分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌
的群体中，这个群体就称为cDNA
文库。

cDNA
文库与基因组文库的区别在于
cDN A
文库是有时效性
的。

cDNA
文库的特点

优 点：
分离的目的基因可直接用于表达；
比
DNA
文库小的多，
容易构 建

缺点：只与编码序列有关；不能反映内含子；不能反映启动
子、终止子以及与核糖 体识别的序列

构建
cDNA
文库的一般步骤：

（
1
）总
RNA
（
total RNA
）提取


（
2
）
mRNA
的分离纯化



①

原理
：利用
mRNA
都含有一段
polyA< br>尾巴，将
mRNA
从
总
RNA
（
rRNA
、
tRNA
等）中分离纯化。


②

mRNA
的分离纯化

Column
（柱）


（
3
）
cDNA
的合成


①

cDNA
第一链合成


②

降解
mRNA
模板


③

cDNA
第二链合成（
cDNA
第二链合成的方法有四种，自
身引 导合成法，置换合成法，引导合成法和引物－衔接头合
成法。
）

（
4
）
cDNA
与载体连接：


（
5
）

噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化（导入宿主中
繁殖）

基因的化学合成 ：寡核苷酸单链的化学合成；探针的化学合
成；连接子和接头的合成；基因的半合成；全长基因化学合< br>成

目的基因的分离：

目的序列已知：一般采用
PCR技术或分子杂交技术分离克隆
目的基因


目的序列未知：差异表达序列 ；无差异表达的目的序列，可
采用文库筛选法、功能蛋白分离法、序列克隆法

基因克隆的方法：

一、目的基因的功能克隆

二、

序列克隆法


三、差别杂交法

四、减法杂交技术

五、
mRNA
差别显示技术

功能克隆：根据已知基因的产物推断出其相应核苷酸序列，
再根据此序列合成寡核苷酸探针，从
cDNA
文库或基因组文
库中调取目的基因

表型克隆：如差异筛选法、差减 杂交（
SH
）
、
mRNA
差别显
示技术（
DDRT -PCR
）
、代表性差异分析（
RAD
）
、抑制型差
减杂交 （
SSH
）等

无基因序列及表达功能信息，但具有基因遗传图，转座子标< br>签等条件，常用图位克隆和转座子标签法克隆

目的基因的功能克隆：在纯化相应的编码 蛋白后构建
cDNA
文库或基因组文库，然后从文库中筛选目的基因

1
、根据特异蛋白分离目的基因

分离、纯化目的蛋白

测定特异的氨基酸顺序

推测编码该蛋白的核苷酸序列

人工合成一段寡核苷酸探针

从
cDNA
文库或基因组文库中筛选编码基因

分离、纯化目的蛋白

目的蛋白免疫动物，制备抗体

从
cDNA
表达文库中筛选目的基因

根据特异蛋白分离目的基因局限性：


特异蛋白已鉴定并分离纯化

某些基因产物，难以分离纯化

非所有基因有蛋白质产物

遗传密码的简并性

2
、功能互补法克隆基因：利用被克隆的外源片段与宿主 细胞
染色体
DNA
具有功能互补。

筛选营养缺陷型互补基因

序列克隆法：根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基
因；采用核酸探针杂交筛选或用
PCR
技术进行分离

差别杂交法： 组织特异性表达或特定发育阶段表达的基因；
受生长因子调节的基因；经特殊处理诱导表达的基因

应用前提：基因在两种不同的细胞群体中的差异性表达（一
个细胞群体中正常表达，另一个 细胞群体中目的基因不表
达）
。

基本过程：制备两种细胞群体的的
mRNA
提取物；以两种总
mRNA
或
cDNA
为探针；以表达目的 基因的细胞群体构建
cDNA
文库

局限性：

灵敏度比较低，不适于低丰度
mRNA
目的基因分离

需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑

差别杂交重复性较差

不同滤膜间
DNA
保有量不均一

杂交信号强度不一致


重新点杂交

减法杂交技术：又称差减杂交、扣除杂交、减数杂交、消减
杂交

本质：尽量 去除两种样品中普遍共同存在的基因序列，从而
使目的基因序列得到有效的富集，从而提高基因筛选分离 的
敏感性

mRNA
减法杂交；基因组减法杂交

感受态细胞的制备：

1
、
挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种于
2 mL LB
液体培养基
中，
37
℃振荡培养过夜

2
、
按
1
％的接种量接种于
3 mL
新鲜
LB
培养液，
37
℃剧烈振
荡培养至
OD600
为
0.4-0.6(
可见雾状
)
3
、倒至
1.5mL
的eppendorf
管中
,4
℃下
12,000
rpm
离心
1
min
，倒出培养液，用无菌滤纸尽量吸干

4
、
加入
1mL
预冷的无菌
0.1mol·
L-1 CaCl2
溶液涡旋，
4
℃下
12,000 rpm
离心
30
秒
,
尽量去除上清

5
、沉淀以
50-100
μ
L
预冷的
0.1mol·
L-1
CaCl2
重悬，
4
℃保
存备用，
7d
内可用。

大肠杆菌的转化方法：

2
＋诱导大肠杆菌转化法

CaCl2
的诱导原因：在
0
℃的
CaCl2
低渗溶液中，细菌细胞
发生膨胀，

Ca 2
＋使细胞膜磷脂层形成 液晶结构，促使细胞
外膜与内膜间隙中部分核酸酶解离，诱导形成感受态


Ca
2
＋

能与加入的
DNA
分子结合，形成抗 脱氧核糖核酸酶
的羟基－磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；
42
℃热激处
理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙。

对照试验：转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性

2.
电穿孔转化法

基本原理：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进 行
电穿孔，形成可逆的瞬间通道，促进外源
DNA
的有效吸收。

影响因素：电场强度，电脉冲时间，外源
DNA
浓度

3.
三亲本杂交接合转化大肠杆菌

重组
DNA
分子导入植物细胞


（
1
）农杆菌介导的
Ti
质粒载体转化法

作用机 制：
将待转移的目的基因组入农杆菌中的
Ti
质粒载体；
农杆菌识别敏感植物 ，将
Ti
质粒的
T-DNA
转移到植物细胞
内部

基本程序：选择合适的外植体；农杆菌的接种操作；洗菌并
筛选培养

常用方法：

1.
创伤植株感染法

2.
共培养感 染法：叶盘转化法；植物愈伤组织共培养转化法；
植物悬浮细胞共培养转化法；原生质体共培养转化法< br>
（
2
）
DNA
的直接转移法：多聚物介导法；电穿孔转化法 ；激
光微束穿孔转化法；显微注射法；超声波介导转化法；基因
枪法；脂质体介导法；花粉管通 道法


重组
DNA
分子导入哺乳动物细胞


病毒介导的转染：病毒颗粒转导法

生化转染：磷酸钙转染法；
DEAE－葡聚糖转染法；聚阳离子
－
DMSO
转染法；脂质体介导法

物理转染：显微注射法；电穿孔法

常见的筛选重组子方法

1
遗传表型直接筛选：抗药性筛选；插入失活筛选法；插入
表达筛选法；显色互补筛选法

2 PCR
法鉴定

3
酶切法鉴定

4
杂交法鉴定：
Southern blot
；
Northern blot
；
Western blot
等

5
测序

原核生物基因表达的特点

①

只有一种< br>RNA
聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有
RNA
的合成。

②

基因的表达是以操纵子为单位的。

③

原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进
行的。

④

原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞
的转录后加工系统。

⑤

原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基
因产物的直接控制要慢。

⑥

mRNA
的核糖体结合位点上，
含有一个
S-D
序列，
而真核

基因则缺乏此序列。

启动子的特性：列特异性；向性；置特异性；属特异性

几种类型的原核表达载体

非融合蛋白

：不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达
蛋白

优点：它具有非常接近 于真核细胞体内蛋白质的结构，因此
表达产物的生物学功能也就更接近于生物体内天然蛋白质。

缺点：易被细菌蛋白酶破坏。

融合蛋白：由一条短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真
核蛋白质结合在一起。

优点：大大增加，不易被细菌蛋白酶降解；于分离纯化

影响基因表达效率的因素：启 动子的强度、
DNA
转录起始序
列、密码子的选择、
mRNA
分子的 二级结构、转录的终止、
质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞的生理特征等

提高基因表达效率的途径：

1.
采用强启动子；
35
和< br>-10
区之间保持的距离（
16
～
19bp
）
2.
确定合适的
SD
序列后面的几个碱基成分及起始密码子上游
的碱基成 分

3.
起始密码子和
S-D
序列之间的距离必须接近到一定程度（
7
个核苷酸时最合适）

4.
在基因内部的适当位置上存在着转录的 终止区，
就能够保证
使质粒的拷贝数
(
也就是基因的表达效率
)控制在一个正常的
水平上。


5.
提高基因的拷贝数（将基因克隆到松弛型的质粒载体上）

6.
轻细胞的代谢负荷：

（
1
）诱导表达：细菌的生长与 外源基因的表达分开，是减轻
宿主细胞代谢负荷的最为常用的一个方法

(2)
表达载体的诱导复制：
将宿主菌的生长和质粒的复制分开

7.
高表达蛋白的稳定性，防止其降解


(1)
克隆一段原核序列，表达融合蛋白

(2)
采用某种突变菌株，保护表达蛋白不被降解

(3)
表达分泌蛋白




基因工程的应用：

医药业：疾病的预防
;
病的诊断
;
病的治疗

农业及食品工业
:

提高作物抗性
;
良作物品质
;
长果实货架期
;
用农作物生产药物

畜牧业
;
工食品

环境
:

环境检测
;
环境净化


第一章


基因工程的概念

第一节

基因工程诞生的
理论基础


一
.
确定了遗传信息 的携带者是
DNA
而不是蛋白质。明确了遗传的物质基础问题

1.
肺炎双球菌转化实验

1944
年
Avery
，确定了基因的分子载体是
DNA
，而不是蛋白质。

2.
噬菌体转染实验

1952
年
Alfred Hershy
和
Marsha Chase
进一步证明遗传物质是
DNA < br>二
.
揭示了
DNA
分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，解决了基 因的自我复制和传递的问题。

1953
年
James D. Watson
和
Francis H. C. Crick
揭示了
DNA
分子的双螺旋结构和半保留复制机
制。
< br>三
.
提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息 的流向和表达
问题