基因操作技术

2021年2月28日发(作者：外阴图)
1.
载体的定义？

载体：指携带外源基因进入受体细胞的运载工具，它的本质是
DNA
复制子。

2.
载体必须具备的
3
个基本条件
?
载体的碱基对越多越好 ？

（
1
）基本条件：
1
具有复制子，
能在宿主细 胞内自主复制，
并携带重组
DNA
分子一同扩增；

2
具有 单一限制性内切酶的酶切位点或多克隆位点；
3
有合适的选择标记基因，用来筛选重

组
DNA
。

（
2
）
载体的碱基对越少越好，能够更好的控制目的基因

3.
目前研究最深，使用最多的载体有？

目前研究最深、使用最多的载体是经过改造的质粒载体和噬菌体载体。

4.
按功能分，有哪些载体？克隆载体的概念？表达载体的概念？

（
1
）按功能分，可分为克隆载体、表达载体、测序载体、转化载体、穿梭载体、多功能载
体等 。
（
2
）克隆载体：
携带插入外源片段的质粒或噬菌体，
从而产生更 多物质或蛋白质的产
物。
（
3
）
表达载体：
在克隆载体基本 骨架的基础上增加表达元件
（如启动子、
PBS
、
终止子）
，
使目的基因能够表达的载体。

5.
选择标记有哪些？插入失活、
a-
互补是什么意思？

（
1
）选择标记有插入失活和
a-
互补（
2
）插入失活:
若把外源
DNA
片段插入到载体的选择标
记基因中而使基因失活，丧失 其原有的表性特征。
（
3
）
a-
互补：单独存在的
a
及
w
片段均无
β
半乳糖苷酶活性，
只有宿主细胞与克隆载体同时共 表达两片段时，
宿主细胞内才有
β
半乳
糖苷酶活性，使特异性作用物变为蓝色 化合物。

6.
列举常用的质粒载体名称？

PBR322
质粒、
PUC
载体、
TA
克隆载体

7.
噬菌体的溶原状态是指？

噬菌体感染大肠杆菌时，
可能进入一 个溶菌循环，
结果导致细胞的裂解，
释放出噬菌体颗

粒；
或者进入与宿主不同程度的稳定状态。

8.
噬菌体
DNA
由哪三个部分组成？目的基因插入哪个部分？
< br>（
1
）噬菌体
DNA
由左臂、中臂、右臂三部分组成。
（2
）目的基因插入中臂（非必须区）部
分。

9.
超级载体的特点？有哪些超级载体？

1
）超级载体的特点：运 载量大（
2)
超级载体：
YACs
、
BACs

10.
表达载体与克隆载体有什么最大的区别？

表达载体有强大的启动子和
SD
序列，而克隆载体没有

11.
限制性内切酶

限制性内切酶：能识别
DNA
分子上 的特定位点并将双链
DNA
切断的酶


连接酶，
T4
连接酶

DNA
连接酶：一种能够在 两条
DNA
链之间催化
5
’
-P
和
3
’< br>-OH
形成磷酸二酯键的酶





T 4
连接酶：连接黏性末端或平末端的酶


聚合酶，
Taq
聚合酶

DNA
聚合酶：催化脱氧 核糖核苷三磷酸（
dNTPs
）聚合成
DNA
的酶


Taq
聚合酶：从嗜热水生菌中分离纯化出来的

14.
逆转录酶


逆转录酶：又称依赖于
RNA
的
DNA
聚合酶，是分子生物学中最重要的核酸酶之一。

15.
核酸酶，
DNase,Rnase
核酸酶：
通过切割相邻两 个核糖酸残基之间的磷酸二酯键，
从而导致核酸分子发生水解断裂
的蛋白酶



DNase:
即脱氧核糖核酸酶，特异水解断裂
DNA
分子的酶



RNase:
即核糖核酸酶，专门水解断裂
RNA
分子的酶

16.
碱性磷酸酶，细菌性
/
小牛肠碱性磷酸酶

碱性磷酸 酶：
有两种不同来源的碱性磷酸酶：
一种是从大肠杆菌中纯化出来的，
叫做细菌碱性磷酸酶；
一种是从小牛肠中纯化出来的，
叫做小牛肠碱性磷酸酶。
它们能催化核 酸分子脱
掉
5
’磷酸基团，从而使
DNA
或
RNA
片段的
5
’
-P
末端转换成
5
’
-OH
末 端。



细菌碱性磷酸酶：一种是从大肠杆菌中纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶



小牛肠碱性磷酸酶：一种是从小牛肠中纯化出来的，叫做小牛肠碱性磷酸酶


与基因的区别？

基因是有遗传功能的
DNA
片段


的链是通过什么方式连接的？两条
DNA
单链是通过什么键连接在一起的？< br>

（
1
）磷酸二酯键；
（
2
）氢键


中四种碱基对的名称？

A
（腺嘌呤）
、
G
（鸟嘌呤）
、
C
（胞嘧啶）
、
T(
胸腺嘧啶）


和
RNA
的区别？

（
1
）
DN A
是脱氧核酸；
RNA
是核糖核酸；
（
2
）这两种核糖的区 别在于脱氧核糖
2
’
-
碳原子
上的羟基被脱了氧，只剩下
H
，这个区别使得
DNA
比
RNA
更具有化学稳定性

21.
遗传信息是如何表达（翻译、传递）的？

P18

,tRNA,rRNA
的功能分别是什么？

mRNA
功能：信使





tRNA
功能：转运





rRNA
功能：仓库

23.
基因突变有哪几种类型？

染色体突变，特点突变

24.
操纵子的概念？

概念：在 细菌中，一组基因受一个启动子控制，被转录成一个长的
RNA
分子，这样的一组
基因 成为操纵子。

25.
简述乳糖操纵子的作用机理？

26.
增强子的概念？沉默子的概念？

增强子的概念：能强化转录起始的一段
DNA
序列为增强子或强化子






沉默子的概念：也称为沉默子元件，能够同反式 因子结合从而阻断增强子及反式激活
因子的作用，并最终抑制该基因的转录活性。

27.
真核生物，原核生物，病毒的基因组特点？

真核生物基因组的特点：
1
基因组通常比较大
2
）含有内含子序列
3
）
有大 量重复序列
4
）表
达调控较复杂






原核生物基因组的特定：
1)
染色体不与组蛋白结合
2)
不同生活习性下原核生物基因组
大小与
GC
含量有关







病毒基因组的特点：
1
）
种类单 一
2
）
单倍数基因组，
每个基因在病毒中只出现一次
3
）< br>形式多样
4
）大小不一
5
）基因重叠
6
）动物、细菌 病毒与真核、原核基因相似，内含子
7
）
具有不规则的结构基因
8
）
基因编码区无间隔，
通过宿主及病毒本身酶切
9
）
无帽状结构
10
）
结构基因没有翻译起始序列


28.
基因操作基本步骤？

基本步骤：扩、切、接、转、增、检

29.
目的

基因分离有哪些方法？分别有什么样的特点？

分离方法：
1
）鸟枪法
2
）反转录法
3
）人工合成法
特点
1
）鸟枪法：操作简单，广泛使用，工作量大，盲目有时并非一个基因






2
）反转录法：专一性强，操作过程麻 烦，
mRNA
很不稳定要求的技术条件高






3
）人工合成法：专一性强，仅限于合成核苷酸对较少的简单基因


技术的目的是什么？操作的步骤和各步骤中发生的反应分别是什么？

PCR
技术的目的是：能将待扩目的基因扩增放大几百万倍



操作步骤：循环变性——退火——延伸



反应：循环变形：通过 加热使模版
DNA
完全变性成为单链同时引物自身和引物之间存在



的局部双链也得以消除



退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模版
DNA
退火结合



延伸：将温度升高，热稳定后
DNA
聚合酶以
dNTP
为 底物催化合成新的
DNA
链

31.
基因操作的理想载体是什么？

理想载体：质粒、噬菌体、柯斯质粒

/RNA
提取过程中有哪些注意事项
?
DNA
提取注意事项：1)DNA
样品不纯
2)DNA
降解
3)DNA
提取量

RNA
提取注意事项：
1
）
RNA
样品不纯
2< br>）
RNA
得率低
3
）
RNA
容易降解

33.
什么原因导致其不纯？对策？

34.
什么原因导致得率低？对策？








P80 84
35.
什么原因导致降解？对策？

36.
简述常见的核酸检测方法？

1
）紫外光谱分析法
2
）荧光分光光度法
3
）凝胶电泳法

37.
纯
DN A
的
00260/280
？纯
RNA
的
00260/280
？

纯
DNA
的
OD260/OD280
应大于
1.8





纯
RNA
的
OD260/OD280
应达到
2.0

38.
荧光分光光度法的特点？

灵敏度高
2
）信息多
3
）专一性强

39.
凝胶电泳法的大致机理？

机理：带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动

40.
影响核酸保存的关键因素？

1
、保存液的酸碱度



2
、保存湿度

41.
提纯的核酸如何保存？



固态核酸通常在
0
℃以上低温干燥保存即可。小分子核酸保存温度还可以更低一些。






液态核酸室温容易变性，短期最好低温（
4
摄氏度）保存。

42.
遗传物质提取过程中有哪些常见的缓冲溶液？





EDTA




Tris-Hcl



TAE




TBE




TE
43.
核酸提取的两个原则？

1.
应保证核酸一级结构的完整性

2.
排除其他分子的污染

44.
核酸提取应注意哪些问题？

P80 84

45.
核酸提取的基本步骤？

破碎、提取、纯化

46.
常见细胞的裂解方式？