基因工程总结

2021年2月28日发(作者：儿童精神分裂症)
简述
Southern blot,northern blot,western

blot
的原理，比较它们的不同
.

答：

Southern Blot

原理：



将 待检测的
DNA
分子用
/
不用限制性内切酶消化后，通过琼
脂糖凝胶 电泳进行分离，
继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙
膜上，
固定

后再与同位素或其它标记物标记的
DNA
或
RNA
探针进行反应。
如果待检物中
含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游 离探针洗涤后用自

显影
或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。



用途：检测样品中
的
DNA
及其含量，了解基因的状态
,
如是否有点突变、
扩增重排等。



DNA =>
琼脂糖电
泳

=>
印迹转移

=>
预杂交

=>
杂交（变性探针）

=>
洗膜

=>
放射自显影或显色

Northern Blot


原理：在变性条件下将待检的
RNA
样品进行琼脂糖 凝胶电泳，继而按照同
Southern Blot
相
同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。

用途：检测样品中是否含有基因的转录产物
（
mRNA
）及其含量。




mRNA
提取

=>
甲醛变性电泳

=>
印迹转移

=>
预杂交

=>
杂交
（变性探针）

=>
洗膜

=>
放射自显影或化学发光

Western Blot
与
Southern Blot
或
Northern Blot
杂交方法类似，
但
Western Blot
采用的是
聚丙 烯酰胺凝胶电泳，
被检测物是蛋白质，
“探针”是抗体，
“显色”用标记的
二 抗。经过
PAGE
分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）
上，< br>固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，
且能保持电泳分离的多肽类型及其生
物学活性不变 。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，
与对应的抗体起免疫反
应，
再与酶 或同位素标记的第二抗体起反应，
经过底物显色或放射自显影以检测
电泳分离的特异性目的基因 表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平
的表达。

不同：所用于分析的对象不同。

Northern
杂交用于分析
RNA
；

Southern
杂交用于分析
DNA
；

Western
杂交用于分析蛋白质。


基因工程
（
genetic
engineering
）


又称
基因
拼接技术和
DNA
重组技术
，是以分子遗传学
为理论基础，
以
分子生物学
和
微生物学
的现 代方法为手段，
将不同来源的基因按预先设计的
蓝图
，在体外构建杂种
DNA
分子
，然后导入
活细胞
，以改变生物原有的遗传特性、获得新
品种、 生产新产品。
基因工程技术
为
基因
的结构和功能的研究提供了有力的手段。< br>


转基因动物与转基因植物的产生有什么不同？

答：< br>技术原理相同，
用转基因技术将具体特殊经济价格的外源基因导入动植物体内，
不但表< br>达出人类所需要的优良性状（如抗虫，抗病，抗除草剂，抗倒伏，产肉，产蛋量高）
,
还 可
以通过蛋白质重新组合得到新的品种。但是，对动物和植物进行目的基因导入的方法不同。
动 物一般采用显微注射法将带有目的基因的病毒注入细胞；
而植物一般采用农杆菌转化法或
基因枪 法将目的基因导入受体细胞。





限制性内切酶的种类？

答：限制性内切酶

是一类能识别双链
DNA
特定序列，并使磷酸二酯键断开的内切脱氧

核
糖核酸酶，

限制性内切酶根据酶的组成，
裂解方式和所需因子的不同分为三种

类型，
分别
是Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。


Ⅰ型酶
主要指的是：一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多

亚基蛋白复合体。它们可在
远离识别位点处任意切割

DNA
链。

能识别特异性的
DNA
序列
,
但没有固定的切割位点

Ⅱ型酶
主要指的是：能在其识别序列内部或附近特异地切开

DNA
链。它们产生确定的限
制性片段和凝胶电泳条带，因此

是唯一一类用于

DNA
分析和克隆的限制性内切酶，分子
量较小。


Ⅲ型酶
主要指癿是：
一类较大癿兼有限制
-
修饰两种功能

癿酶。
它在识别位点之外切开

DNA
链，并且要求同一

DNA
分子中存在两个反向癿识别序列以完成切割。



酶切反应条件：

答：
1
．缓冲液





常规缓冲液一般包括提供稳定
pH
值的缓冲剂、
Mg++
、
DTT
（二硫苏糖醇）以及
BSA
（小牛血请白蛋白）
。





pH
经常为
7.0-7.9
（在
25
℃

时）
，用
Tris-HCl
或乙酸调节；
Mg++
作为酶的活性中心，
由
MgCl2
和
MgAc
提供；

浓度常为
10mM
；
DTT
浓度常为
1mM
。有时缓冲液中还要加
入
100g/ml BSA
，但只是少数反应需要。不 同的酶对离子强度的要求差异很大，并依次将限
制酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低三种类型， 离子强度以
NaCl
来满足，浓度分
别为
100mM
、
50mM
和
0mM
。





要对
DNA
进行双酶切时，
如何选择缓冲液是相当重 要的。
一方面可选用都合适的缓冲
液或通用缓冲液；若找不到共用的缓冲液则先用低浓度的，再 加适量
NaCl
和第二种酶；或
先用低盐缓冲液再用高盐缓冲液（
DNA
可纯化或不纯化）
。


2
．反应温度






反应温度大多数为
37
℃

，
一部分为
50-65
℃

，
少数
25-30
℃

。
高温作用酶在
37
℃

下
的活性会下降，多数仅为最适条件下的
10-50%
。如
Taq
限制酶（正常反应温度为
65
℃）
，
在
37
℃
只有在
65
℃

活性的
10%
；

Apo
Ⅰ（正常反应温度为
50
℃）
，

37
℃只有在
50
℃

时
活性的
50%
。销售商在产品说明中都会标明最佳反应温度。

3
．反应时间





反应时间通常为
1
小时或更多，许多酶延 长反应时间可减少酶的用量。
EcoR
Ⅰ若反应
16
小时，所需酶量为正常酶 切时间的
1/8
，即若反应时间为
16
小时，则所用酶量为只切
1< br>小时的
1/8
。其它一些酶也有类似情况，如
Hind
Ⅲ为
1/8
；
Kpn
Ⅰ为
1/4
；
BamH
Ⅰ为
1/2
。

4
．终止酶切的方法

EDTA
可鏊合镁离子，
从而可终止酶切反应，
终止浓度为
10mM
；
加热是常用的方法，
对于最佳反应温度为
37
℃

的酶，
在
65
℃

或
80
℃

处理
20
分钟可使酶活性大部分丧失。
但
是对于在
80
℃

作用
20
分钟也有不失活的酶，如最佳反应温度为
37
℃

的酶
Bg1
Ⅱ、
Hpa
Ⅰ
和

Pvu
Ⅱ，
65
℃

酶
Tth111
Ⅰ和
TspR
Ⅰ，以及
50
℃

酶

Bc1
Ⅰ，可用苯酚抽提去除蛋白，或
用试剂盒纯化
DNA
。





柯斯质粒载体的特点：

答：第一、具有
λ
噬菌体的特性。柯斯质粒载

体克隆了合适长度的外源
DNA
，并在

体外
被包装成噬菌体颗粒后，
可以高效

地转导对
λ
噬菌体敏感的大肠杆菌寄主

细胞。
但该载体
不包含
λ
噬菌体的全部

必要基因，因此不能够通过溶菌周期，

无法形成子代噬菌体颗粒


二、具有质粒载体的特性

柯斯质粒载体具有质粒复制子，能够在寄主

细胞中象质粒
DNA
一样进行复制，


通常具有抗菌素抗性基因，可作为重组体分

子表型选择标记，其中一些
还带有基因插入

失活的克隆位点。



第三、具有高容量的克隆能力


柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，

一两个选择记
号和
cos
位点等三个组成部分，

其分子量较小，一般只有
5
～
7kb
左右，及

柯斯质粒载体
的克隆极限可达
45kb
左右。



第四、
具有与同源序列的质粒进

行重组的能力



一旦柯斯质粒与一种带有同源序列的质粒
共

存在同一个寄主细胞当中时，它们之间便会

形成共合体。



转基因动物的主要目的：





一

名词解释

转基因动物
：
是指以人工方法导入 外源基因，
在染色体内稳定整合并能遗传给后代的一类动
物。

转基因生物：
在生物基因组中带有用转基因技术插入的外源基因，
生物个体能将它遗传给后
代并表达 出该基因的生物活性物质，从而使受体生物获得新的性状。

核酶
：是具有催化功能的
RNA
分子，是生物催化剂，可降解特异的
mRNA
序列。核酶又称
核酸类酶、酶
RNA
、

核酶类酶
RNA
。
插入失活
：当外源
DNA
插入到载体的某一基因中间时，该基因就不能表达，这种 现象称为
插入失活。

结构基因
：包括以
5
端
mR NA
转录位点开始到
3
端
mRNA
终止信号结束的全部功能单位。< br>

目的基因
：
决定生物的优良性状，
具有应用价值的应用前 景，
并被用于构建物种新特性的基
因。

操纵子
：
功能密切 相关的基因聚集在一起，
处于同一转录启动的调控之下，
并且有相同的转
录终止区。< br>
启动区
：
RNA
聚合酶识别，结合和开始转录的一段
DNA
序列。

终止子
：原核生物基因在转录终止前的一段提供转录终止信号的DNA
序列。

终止因子
：帮助
RNA
聚合酶识别终止信号的辅助因子。

双元载体
：即能在宿主自我复制，又能转化感染其它宿主的载体。

温和噬菌 体
：
λ
DNA
可以整合到宿主细胞染色体，以溶源状态存在并随染色体的复制 而复
制。

插入型载体
：当外源
DNA
片段插入后使载体所 具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而
不能进入溶菌周期。

表达序列标签
：
EST
是从一个随机选择的
cDNA
克隆 进行
5
’端和
3
’端单一次测序获得的
短的
cDNA
部分序列，代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从
20
到
7000bp
不等，平均长度为
360
±
120bp
。
EST
来源于一定环境下一个组织总
mRNA
所构
建的
cDNA
文库，因此
EST
也能说明该组织中各基因的表达水平。

基因文库
：是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体
中，
以 备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因，
这种保存基因遗传信息的材料称为
基因文库。

移动基因
：
能从染色体的一个位置转移到另外一个位置，
甚至在不 同的染色体之间跳跃的基
因。

断裂基因
：基因内部插入有与氨基酸编码无关 的
DNA
间隔区，使一个基因分隔成不连续的
若干片段。

重叠基因
：两个基因内部存在重叠的读码框。




二

考点整理

1
、常用植物基因转化方法特点比较。







2
、插入失活例子

PBR322
有四环素抗 性基因和氨卡青霉素抗性基因，在四环素抗性基因内有
BamH
Ⅰ和
Sal
Ⅰ 两种限制酶切位点，如果在这两个位点中有外源
DNA
插入，都会导致四环素抗性基因失
活。将转化后的细胞分别培养在含氨卡青霉素和四环素的培养基中，便可检出转化子细胞。

3
、
TAC
载体的蔗糖致死和卡那霉素抗性
。







4,
、蓝白斑筛选

蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：

是根据载体的遗传特征筛选重组子，如
α
-
互补、抗
生素基因等。
现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA
的短区段，
其中有
β
-
半乳糖
苷酶基因（
lacZ
）的调控序列和前
146
个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个 多
克隆位点
（
MCS
）
，
它并不破坏读框，
但可使 少数几个氨基酸插入到
β
-
半乳糖苷酶的氨基端
而不影响功能，这种载体适用 于可编码
β
-
半乳糖苷酶
C
端部分序列的宿主细胞。因此，宿
主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。
这样，lacZ
基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实
现 了互补，称为
α
-
互补。由
α
-
互补而产生的
La cZ+
细菌在诱导剂
IPTG
的作用下，在生色
底物
X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源
DNA
插入到质粒的多克隆
位 点后，几乎不可避免地导致无
α
-
互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形 成
白色菌落。
这种重组子的筛选，
又称为蓝白斑筛选。
如用蓝白斑筛选则经连 接产物转化的钙
化菌平板
37
℃温箱倒置培养
12-16hr
后，有 重组质粒的细菌形成白色菌落。

设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为
β
-
半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基