-
Chelex
法提取血液（斑）
DNA
原理
:
Chelex
是由苯乙烯与二乙烯苯的共聚体组成的螯合树脂，其亚氨基二乙酸侧链起着螯合 金属离子的作用，防止在
其煮沸过程中
DNA
的降解，在高温低离子强度下也起着催化
DNA
释放的作用。
对检材的条件要求
液体血用
EDTA
溶液（
0.5M EDTA
：血
=50
μ
l
：
3ml
）或枸橼酸钠溶 液（
2.5%
枸橼酸钠：血
=1
：
4
）抗凝，勿用肝
素抗凝，须冷藏保存送检。
操作步骤
:
1
、
取
4
μ
l
血液（或
3
×
3mm2
血斑样品）放入< br>0.5ml
的离心管中，加入
0.5ml
纯水，振荡混匀，室温浸泡
1 5-30
分钟。
2
、
13,000rpm
离心
3
分钟，去除上清液〔上清液可用于做抗人血红蛋白（
FOB
）金标试剂条检验〕，若是血斑则保
留载体。
3
、加入
200
μ
l 5% Chelex-100
溶液，
56
o
C
保温
15-30
分钟，振荡
5-10
秒。
4
、沸水中煮
8
分钟（或在热循环仪上
100
o
C
保温
8
分钟），振荡
5-10
秒。
5
、
13,000rpm
离心
3
分钟，
4
o
C
保存备用。
注意事项：
1
、
5% Chelex-100
溶液使用前摇匀，用量视检材的量而定。
2
、液体血用
EDTA
溶液（
0.5M EDTA
：血
=50
μ
l
：3ml
）或枸橼酸钠溶液（
2.5%
枸橼酸钠：血
=1
：
4
）抗凝，冷藏
送检。
3
、液体血涂在滤纸或脱脂纱布上制成血 斑时，应在室温下自然晾干，放入纸袋内送检。
4
、血斑应保留载体，皮革上的血迹最好用纱线转移提取。
5
、纯水洗一次后，若颜色还很红，可用水再洗一遍。
6
、微量血斑可不经水洗，直接加入适量
5% Chelex-100
溶液保温。
7
、陈旧血斑可加入蛋白酶
K
，并适当延长保温时间。
Chelex
法提取唾液（斑）
DNA
适用范围：
该方法适用于各种载体上的唾液斑，常见的有口腔拭子、烟蒂、邮票、信封折口、
牙刷、果核、饮料罐、水杯、面罩及咬痕等。
原理：
Chelex
是由苯乙烯与二乙烯苯的共聚体组成的螯合树脂，其亚氨基二乙酸侧链起着螯合 金属离子的作用，防止在
其煮沸过程中
DNA
的降解，在高温低离子强度下也起着催化
DNA
释放的作用。在
Chelex
中加入蛋白酶
K
，有助于口
腔上皮细胞的消化。
操作步骤
1
、取
3
×
3mm2
唾液斑样 品（过滤嘴纸质外层、唾液斑转移纱线）或剪取牙刷刷毛
1
束，放入
0.5ml
的离心管中，加入
0.5ml
纯水，振荡混匀，室温浸泡
15-30
分钟。
2
、
13,000rpm
离心
3
分钟，去除上清液，保留载体。
3
、加入
100
μ
l 5% Chelex-100
溶液和
5
μ
l 2mg/ml
蛋白酶
K
，
56°
C
保温
2
小时以上，
振荡
5-10
秒。
4
、沸水中煮
8
分钟（或在热循环仪上
100°
C
保温
8
分钟），振荡
5-10
秒。
5
、
13,000rpm
离心
3
分钟，
4°
C
保存备用。
注意事项：
1
、多枚烟蒂应分别放入不同纸袋内送检，标明商标和提取地点。
2
、口腔拭子应在室温下自然晾干，放纸袋内送检。
3
、饮料罐、 水杯口上的唾液斑可分两步提取转移，先用湿棉签或纱布擦拭，再用干棉签或纱布擦拭，一并放入离心
管 中提取
DNA
。擦拭时尽量少用载体。
4
、对于量少的检材可不经水洗，直接加入
5% Chelex-100
溶液和蛋白酶
K
保温。
Chelex
法提取组织
DNA
适用范围：
人体的各种器官组织如心脏、脑、肌肉、软骨及毛根等。
原理：
Chelex
是由苯乙烯与二乙烯苯的共聚体组成的螯合树脂，其亚氨基二乙酸侧链起着螯合 金属离子的作用，防止在
其煮沸过程中
DNA
的降解，
在高温低离子强度下也起着催化
DNA
释放的作用。
在
5%
的
Chelex-100
中加入蛋白酶
K
溶
液，有助于组织细胞的消化和
DNA
释放。
操作步骤
1
、剪取组织约
1mg
，放入
0.5ml
的离心管中，加入
200
μ
l 5% Chelex-100
溶液和
10
μ
l
的
2mg/ml
蛋白酶
K
；剪单根
毛发的毛根，加入
50
μ
l 5% Chelex-100
溶液和
5
μ
l 2mg/ml
的蛋白酶
K
，
56?
C
保温
2
小时以上，振荡
5-10
秒。
2
、沸水中煮
8
分钟（或在热循环仪上
100?
C
保温
8
分钟），振荡
5-10
秒。
3
、
13,000rpm
离心
3
分钟，
4?
C
保存备用。
注意事项
1
、焚烧的尸体应取深层肌肉，严重腐烂尸体应提取软骨。
2
、多根毛发的毛根应分别提取
DNA
。
3
、带毛根的毛发干燥状态下保存送检，组织应冷冻保存送检。
4
、组织
DNA
含量较大，取材时不要过量。
5
、若组织表面较脏，应先用纯水冲洗，去除烟尘、泥土等杂质。
6
、毛根表面若粘有血迹或其他斑迹，应先用脱脂棉蘸纯水擦拭干净。
Chelex
法提取指（趾）甲
DNA
适用范围
该方法适用于人类指（趾）甲。
原理
指（趾）甲的主要成份为< br>α
-
角蛋白，也含有人体细胞。在二硫代苏糖醇（
DTT
）存在的条件 下，蛋白酶
K
可将
α
-
角蛋
白水解，在高温下破坏细胞内 的膜结构，释放出细胞内的线粒体
DNA
、核
DNA
。
对检材的条件要求
样品表面清洁，面积在
5mm2
以上。
操作步骤
1
、清洁指（趾）甲的表面：先用洗涤剂或去污剂的稀释溶液擦洗 指（趾）甲的表面，然后用手术刀片再刮
去一层表面，最后用纯水清洗，取出后用滤纸压干。
2
、将适量指（趾）甲样品剪为碎片，转移至
0.5ml
的离心管中，加入100?l
5%Chelex
-100
溶液，10?l
4M
DTT 溶
液，10?l 5mg/ml 蛋白酶
K
溶液，混匀，56°C 保温
4
小时以上。
3
、沸水中煮
8
分钟（或在热循环仪上
100?
C
保温
8
分钟），振荡
5-10
秒。
4
、
13,000 rpm
离心
5
分钟，4°C 保存备用。
注意事项
1
、对于一些难于酶解的检材可以适时、适量补加蛋白酶
K
。
2
、
Chelex
法提取后的检材，可使用
Promega
公司 的
DNA IQ
系统进行纯化，浓缩。
Chelex-100
法提取混合斑中女性
DNA
适用范围
该方法适用于混合斑中女性
DNA
的提取。
原理
在没有
DTT
存在的情况下，
混合斑中的精子不会裂解释放出
DNA
，
用
Chelex-100< br>法提取到的混合斑中
DNA
主要为
女性
DNA
。
操作步骤
1
、取
3×
3mm2
混合斑检材放入< br>0.5ml
的离心管中，加入
200
μ
l 5% Chelex-100
溶液和
10
μ
l 2mg/ml
蛋白酶
K
，
56?
C
保
温
1
小时以上，振荡
5-10
秒。
2
、
13,000rpm
离心
3
分钟，吸取上清液至
0.5ml
的离心管中，沸水中煮
8
分钟（或在热循环仪上
100?
C
保温
8
分
钟），振荡
5-10
秒。
3
、
13,000rpm
离心
3
分钟，
4?
C
保存备用。
注意事项
1
、通常
STR
检验分型结果为单一的女性基因型，男性谱带的峰值很低，与背景噪音相当。
2
、特殊情形下，如混合斑中若混有男性血或含有大量男性上皮细胞等，则
STR
分型为混合谱带。
Chelex
法提取混合斑中精子
DNA
适用范围
该方法适用于阴道拭子和各种载体上含有精子的混合斑。
原理
利 用女性上皮细胞与精子结构上的差异，
首先在蛋白酶
K
和
SDS
作用 下裂解上皮细胞，
分离去除上清
(
女性
DNA)
、
保留沉淀
(
精子的头部
)
，漂洗去除残留的女性
DNA
；在
DTT
、蛋白酶
K
、
Chelex(
螯合树脂，防止煮沸过程中DNA
的
降解
)
存在的情况下，进行二次消化，释放出精子
DN A
。
操作步骤
1
、将带有精子的检材约
2cm
剪碎，装入
1.5ml
离心管
A
中，
加
lml T NE
溶液或去离子水，
37
℃浸泡
30
分钟。
〔可
13000rpm
离心
3
分钟，后取
100
ul
上清溶液 做抗人前列腺特异抗原（
PSA
）金标试剂条检验，再在
A
管中补加
100
ul
的
TNE
，振荡〕然后加入
10%SDS
（约
100 ul
）至终浓度
1%
，加蛋白酶
K
（约
10 ul
）至终浓度
100ug/ml
，
37
℃保温
2
小时以上（时 间长些效果会更好，因而可过夜）
。
2
、套管离心（将
A
管底部用针穿一个洞，套在另一个管
B
中）
，
13000rpm
离心
5
分钟（或可用
5000rpm
离心
10
分钟、或可用10000rpm
离心
8
分钟）
，弃
A
管。
3
、弃
B
管中上清液，沉淀物加入
1mlTNE
溶液或去离 子水振荡重悬，
13000rpm
离心
5
分钟离心，弃上清液；如
此 反复漂洗一至五次，后
B
管中保留
20-30
ul
的液量做精子< br>DNA
提取。
（沉淀物可保留一半以备女性物质去除不净时
再次进行消化。）
4
、沉淀物中加入
200ul 5%Chelex-l00
溶液、
20ul 10mg/ml
蛋白酶
K
和
10ul 1MDTT
，
56
℃
30
分钟至
4
小时（或过
夜）
。
5
、振荡
5-10
秒，
98
℃
8-10
分钟，振荡
5-10
秒。
6
、
1300 0rpm
离心
3
分钟，
4
℃或
-20
℃保存备用。
注意事项
1
、检材用量不要过大，以利于充分浸泡、消化，并避 免
DNA
模板浓度过高，导致小片段优势扩增。
2
、女性物质过多 时，可延长第一步消化时间，增加漂洗次数
;
或将保留的一半沉淀物再次进行消化。
3
、遇有抑制物干扰时，可通过稀释或用
DNAIQ
系统纯化模板
D NA
来解决。
2
DNA IQ
系统纯化
DNA
适用范围
该方法适用于
DNA
的纯化。
原理
本方法运用
DNA
IQ
系统，对有机法和
Chelex-100
法提取的
DNA
进行纯化。在高浓度
chaotropic
salt
（
NaI、硫氰
酸胍和盐酸胍等）存在的条件下，核酸吸附到二氧化硅上，而在低盐条件下被洗脱下来。
操作步骤
1
、剪取适量检材于
1.5ml
离心管中 ，加
200ul
配制好的裂解液（
100ul
裂解液
+1ul 1M DTT
），
95
℃保温
30
分钟；
2
、 套管离心，去掉载体，将上清液转移至另一个
1.5ml
的离心管；
3、离心管中加入
2
倍体积配制好的裂解液和
7ul
树脂，漩涡振荡使树脂 悬浮，室温放置
5
分钟，期间震荡
3-5
次，以
使树脂保持悬浮；< br>
4
、旋涡振荡后将离心管置于磁架上，小心弃去液体；
5
、加
100ul
配制好的裂解液，旋涡振荡使树脂悬浮，将离心管放在磁力架上，小心弃去液体 ；
6
、加
100ul
配制好的
1
х
洗液 （
2
х
洗液：无水乙醇：异丙醇
=2
：
1
：
1
），旋涡振荡使树脂充分悬浮，将离心管放在
磁力架上，小心弃去液体；
7
、重复三次步骤
7
，最后一次尽量将上清液吸干净；
8
、打开离心管盖子，室温下空气干燥
5
分钟；
9
、加入
50ul
纯水，旋涡振荡使树脂悬浮，离心管放在加热块上，
65
℃ 保温
5
分钟，期间振荡
3-5
次
;
10
、取出离 心管，旋涡振荡使树脂悬浮后，立即将离心管置于磁力架上，小心将
DNA
溶液吸出至干净管中 备用；
注意事项
1
、待纯化的样品在加入裂解液后仍呈粘稠状， 会影响磁铁架吸附树脂，导致离心管放入磁架后树脂不贴壁，仍呈
悬浮状，此时应用裂解液进一步稀释， 或步可将样品在
56
℃加热
1
分钟，溶液即可澄清；
。
2
、每步应尽量吸净液体。
3
、旋涡振荡充分，使树脂在每次洗涤中不发生凝结。
4
、干燥时间不要超过
20
分钟。
5
、低温洗脱导致回收率低，洗脱时应置
65o
保温
5
分钟。
6
、
7
μ
l
树脂只能吸附约
100ng DNA
，因此无需加入过多的
DNA
。
Micoron 100
柱纯化方法
1
、分别标记两个编号一样的
1.5ml
管×（
A
管、
B
管）；
2
、将已用
C HELEX100
法或有机法等已制备好的
DNA
，
13000rpm
离心
3
分钟；
3
、将
micoron
100
柱放在离心管
A
上，往柱子里加适量已制备的
DNA
（约
3 0-50ul
即可），再往柱子里加
100ul
去离子
水，盖上盖子；
4
、将离心管
A
（套有柱子）
1000rpm
离心5-10
分钟（柱子内约保留
20-30
ul
的溶液）
；
5
、从离心管
A
上拆下
micoron-100
柱（弃
A
管），将
micoron-100
柱翻转后放在离心管
B
上，盖上盖子；
6
、将离心管
B
（套有柱子）
13000 rpm
离心
5
分钟；
7
、弃柱子，收集的
DNA
溶液保留在离心管
B
中备用。
抗人血红蛋白（
anti- Hb
）金标试剂条检验人血液（斑）
适用范围
该方法适用于疑含有人血的所有检材。
原理
抗人血红蛋白金标试 剂条检验人血的基本原理是双抗体夹心法。
吸附于试剂条加样区的金标记单克隆抗人
Hb 抗体
与含有人血的检材（样本）浸泡液反应后，形成金标记抗体抗原复合物，并向试剂条吸附区扩散 ，当扩散至试剂条预粘
附有线性未标记的单克隆抗人
Hb
处时，
与未标记的单克隆抗人
Hb
反应，
并沉淀于该处，
形成紫红色沉淀带
（检测线）
。
如果检材（样本）浸泡液中无
Hb
则不能形成紫红色沉淀带。吸附于试剂条加样区的多余金标记单克隆抗人
Hb
抗体越
过检测线，继续向试剂条吸附区扩散，当扩散至试剂条预粘附有线性标记的羊抗鼠
IgG
处时，形成紫红色沉淀带（质
控线）。
对检材的条件要求
人血稀释
8
万倍以下或人
Hb
含量
1000ng/ml
以上。
操作步骤
剪取适量大小疑含有人血斑检材或吸取适量疑含有人血液检材，于
0.5ml
离心管内，加入
450
μ
l
纯水，室温放置
30
分钟，不时振荡，
13,000rpm
，
5
分钟，移上清于另一
0.5ml
离心管内，将试剂条带
MAX
标记一端插入上清中，室
温静置
5
分钟，观察结果。
结果
阳性
:
阳性二条带，质控线及检测线均为阳性。
加样区
反应区
吸附区
检测线
质控线
阴性一条带，仅有质控线。
注意事项
1
、视检材情况确定检材取量、纯水用量及浸泡时间。一般检材室温浸泡
30
分钟，陈旧检材可
4
℃浸泡过夜。
2
、试剂条应置于检材浸泡离心上清液内（不应超过
MAX
线）
5
分钟内观察结果。
3
、试剂条质控线阳性时结果判断才有效。
4
、假阴性的原因包括检材太浓而表现为前滞作用或试剂条灵敏度低等。
5
、假阳性的原因包括抗体的非特异性反应或试剂条反应后久置等。
6
、试剂条应在室温干燥条件下保存，在有效期内使用。
-
-
-
-
-
-
-
-
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