基因工程

2021年2月28日发(作者：徐文)
基因工程：
指将一种或多种生物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者人工合成的基因，按 照人们的愿望进
行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体（受体）的细胞内，使之能在受 体细胞遗传并获得新的
遗传性状的技术。因此，供体、受体、载体是基因工程的三大要素。
< br>基因工程：
指重组
DNA
技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两 大组成部分。

上游技术是指外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（即
DNA重组技术）；下游技术涉及含有重组外源基因
的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养，以及 外源基因表达产物的分离纯化过程。

第二章

用于核酸操作的工具酶：限制性核酸内切酶、
DNA
连接酶、
DNA
聚合酶、核酸修饰酶

核酸内切酶：
在核酸水解酶中，为可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶，与核酸外切 酶相对应。

II
型限制性内切酶

主要特性：
①限制修饰
—
单功能；
②蛋白结构
—
同源二聚体；
③辅助因子
—Mg
2+
；
④识别序列
—
旋转对称序列；
⑤切割位点—
识别序列内或附近特异性切割

基本特性：
①识别双链
DNA
分子中
4
～
8
对碱基的特定序列②大部分酶的切割位点在识别序列内 部或两侧③识
别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构

影响活性的因素：

①
DNA
样品的纯度（蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、
EDTA
、SDS
、
NaCl
等）

措施：
a.
加大酶的用量，
1μg DNA
用
10 U
酶；
b.
加大反应总体积；
c.
延长反应时间

②
DNA
分子构型
:
不同构型
DNA
进行酶切时条件不同；
同一
DNA
分子上不同位置的识别序列，
切割效率明显不
同

③
DNA
样品的甲基化程度：
请看
PPT

④酶的 缓冲液性质
:
高浓度的酶和甘油、
低离子强度、
极端
pH
值 会使核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性

⑤酶的性质：
a.
酶的纯度
b.
酶切反应的温度和时间

DNA
连接酶

基本性质
:
①修复双链
DNA上缺口处的磷酸二酯键；②修复与
RNA
链结合的
DNA
链上缺口处的磷 酸二酯键
（
T4-
连接黏性末端）
③连接多个平头双链
DNA
分子
（
T4-
连接平头末端）

DNA
聚合酶

大肠杆菌
DNA
聚合酶
I
（
DNA pol I
）

基本性质：①
5’→3’
的
DNA
聚合酶活 性②
5’→3’
的核酸外切酶活性③
3’→5’
的核酸外切酶活性

基本用途：制备
32
P
标记的探针（杂交探针的制备）

大 肠杆菌
DNA
聚合酶
I
大片段
Klenow
：
DN A pol I
经枯草杆菌蛋白酶处理，获得
N
端
2/3
的大肽段）
< br>基本性质：①
5’→3’
的
DNA
聚合酶活性②
3’→5’< br>的核酸外切酶活性（
5’→3’
的核酸外切酶活性
——
无）

基本用途：①补平由核酸内切酶产生的
3’
粘性末端；②
DNA
片段 的同位素末端标记

③
cDNA
第二链的合成；④双脱氧末端终止法测定DNA
序列

T4
噬菌体
DNA
聚合酶
基本特性：①
5’→3’
的
DNA
聚合酶活性和
3’→5’的核酸外切酶活性；②在无
dNTP
时，可以从任何
3’-OH
端外切；③在只有一种
dNTP
时，外切至互补核苷酸暴露时停止；④在四种
dNTP
均存在时，聚合活性占主导地位

基本用途：①切平由核酸内切酶产生的
3’
粘性末端；②
DNA
片段的同位素末端标记；

Taq DNA聚合酶：
①
5’→3’
聚合酶活性；②
5’→3’
外切酶活性③ 最适温度
75
～
80
℃，辅助因子
Mg
2+

依赖于
RNA
的
DNA
聚合酶（反转录酶）：

基 本特性：①以
RNA
为模板聚合
cDNA
链；②双向外切
DNA- RNA
杂合链中的
RNA
链；

末端脱氧核苷酰转移酶（
TdT
）

基本特性：来自小牛胸腺；不需 要模板的
DNA
聚合酶，随机掺入
dNTPs

核酸修饰酶

T4-
多核苷酸激酶（
T4-PNP
）

基本特性：在DNA
、
RNA
的
5’–OH
上加磷（用于探针的末端同位素标 记）

碱性磷酸单酯酶
——
脱磷作用：使
DNA
或
RNA
的
5’
磷酸变为
5’–OH
末端

第三章

载体：
基因工程中携带外源基因进入受体细胞的
“
运载工具
”
，本质是
DNA
复制子。

质粒：
生物 细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。

质粒的不相 容性：
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，
不能同时存在于一个细胞中的现象。
不相容性的质
粒组成不相容性群

多克隆位点
MCS
：
载体 上人工合成的含有紧密排列的多种限制性内切酶的酶切位点的
DNA
片段

表达质粒载体：
在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体

载体应具备的条件：

1.

具有能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制

2.

具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点

3.

具有合适的筛选标记基因，用于筛选重组体
DNA

载体的功能
:

1.

运送外源基因高效转入受体细胞

2.

为外源基因提供复制能力或整合能力

3.

为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

（一）质粒

质粒载体： 复制必需区、选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点
(
多克隆位点
)
。

（
1
）质粒的基本特征：

1.

质粒的自主复制性

两大复制类型：①

严紧型复制控制的质粒

1-3
拷贝















②

松弛型复制控制的质粒

10-200
拷贝

2.
质粒的不相容性

3.
质粒的可转移性

某些非接合型质粒
(ColE
Ⅰ
)在接合型质粒的存在和协助下，也能发生
DNA
转移，这个过程由
nic
和
mob
基因
决定

4.
携带特殊的遗传标记
——
使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状：

物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物

物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱

（
2
）质粒的构建

pSC101


9.09 kb
拷贝数
1-2


四环素抗性标记基因
Tc
r

ColE1


6.5 kb
拷贝数
20-30


大肠杆菌内毒素标记基因
E1

pSF2124


ColE
Ⅰ衍生质粒



氨苄青霉素抗性标记基因
Ap
r

（
3
）理想质粒载体的必备条件

①较小的分子质量和较高的拷贝数

②若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点

③具有两种以上的选择性标记基因

④缺失
mob
基因

⑤插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达

（
4
） 重要的大肠杆菌质粒载体
——pUC18/19
：正选择标记
LacZ
的显色 原理（蓝白斑筛选）

（
5
）制备质粒
DNA
的方法：

①氯化铯密度梯 度离心法
——
质粒
DNA
纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染

②沸水浴法
——
质粒
DNA
纯度底、快速、操作简便
③碱溶法
——
质粒
DNA
纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间< br>
（二）大肠杆菌的
λ
噬菌体
DNA

（
1
）
λ
噬菌体
DNA
作为载体的优点：

①
λ
-DNA
可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌

②
λ
-DNA
载体的装载能力为
25 kb
，远远大于质粒的装载量

③重组入
-DNA
分子的筛选较为方便，提取较为简便

④
λ
-DNA
载体适合克隆和扩增外源
DNA
片段，但不适合表达外源基因
（
2
）
λ-DNA
载体的构建：

①加装选择标记：

免疫功能类标记：含标记基因
λ-
载体进入受体
——
浑浊斑；外源
DNA
插入标记基因
——
透明斑

颜色反应类标记：空
λ-
载体
——
蓝色透明斑；外源
DNA
插入标记基因
——
无蓝色

②引入无义突变

（< br>3
）
λ-DNA
载体的主要类型：插入灭活型载体、取代型载体

（三）大肠杆菌的
M13
单链噬菌体
DNA

（
1
）
M13 DNA
载体的特点：

①使克隆的
DNA
片段以特定单链的形式输出受体细胞外
——
这在
DNA
定向突变中非常有用

②
M13
重组分子筛选简便
——
被
M13
噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组
分子越 大，混浊斑的混浊度亦越大

③可从大肠杆菌中制备双链
DNA
，能在体外进行基因克隆

（四）考斯质粒

（
1
）考斯质粒载体的特点：

①能像入
-DNA
那样进行体外包装，并高效转染受体细胞

②能像质粒那样在受体细胞中自主复制

③重组操作简便，筛选容易

④装载量大（
45 kb
）且克隆片段具有一定的大小范围

⑤不能体内包装，不裂解受体细胞

（五）人工染色体载体

（
1
）细菌人工染色体（
BAC
）：
50-300 kb
；（
2
）酵母人工染色体（
YAC
）：
350-400 kb

（六）受体细胞

（
1
）受体细胞应具备的条件：

①限制性缺陷型
——
外切酶和内切酶活性缺陷（

recB
-
，


recC
-
，


hsdR
-

）

②重 组整合缺陷型
——
用于基因扩增或高效表达的受体细胞（
recA
-
）

③具有较高的转化效率

④具有与载体选择标记互补的表型

⑤感染寄生缺陷型
——
防止重组细菌扩散污染，生物武器除外

（
2
）各种基因工程受体的特性

①大肠杆菌
——
外源
DNA
的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是
DNA重组实验和基
因工程的主要受体菌

②枯草杆菌
——
原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌

③链霉菌
——
抗生素生产菌株的改良

④酵母菌
——
外源
DNA
的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达 调控
的研究，是
DNA
重组实验和基因工程重要的真核性受体菌

⑤ 哺乳动物细胞
CHO--
哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，
DN A
重组实验的哺乳动物受体

⑥植物细胞（拟南芥菜、烟叶）
——
高 等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良

第四章

核酸的提取与纯化

基本特性：
在
DNA
、
RNA
的
5’–OH
上加磷（用于探针的末端同位素标记）

三大步骤：< br>①细胞的破碎；②除去与核酸结合的蛋白质及多糖脂等杂质；③除去其它杂质核酸，获得均一的样品

1.
样品预处理：样品应该新鲜；取样后立即低温处理（
-20
℃或-70
℃）冷冻保存

2.
消化与裂解细胞：
不同生物细胞的消 化和裂解有不同的办法，
如酶解法、
碱裂解法、
煮沸法、
有机溶剂抽提法。< br>
SDS
法：
利用高浓度的
SDS
（十二烷基硫酸钠）在较高 温度（
55
～
65
℃）下裂解细胞，使染色体离析、蛋白质变
性、释 放出核酸，提高盐浓度和降低温度沉淀蛋白质和多糖。

CTAB
法：
CTA B
（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，适用于植物组织、真菌等核酸的提取。可溶解细胞
膜，能与核酸形成复合物。在高盐溶液（
0.7mol/L
）中可溶，降低盐浓度（
0 .3mol/L
），核酸析出。

优点：（
1
）能很好的去除糖类杂 质，适用于含糖量的材料；（
2
）能同时得到高质量的
DNA
和
RN A

核酸的检测与保存（
浓度检测、纯度检测、完整性检测
）
浓度检测：①紫外分光光度法
：测定
DNA
在
A
260nm的光吸收值。（
A
260
×
稀释倍数
×50
＝

μg/ml——A
值等于
1
时，相当于
50μg/ml
双链
DNA
，
40μg/ml
单链
DNA
或
RNA，
20μg/ml
单链寡核苷酸）

紫外分光光度法只用于测定浓度大于
0.25?g/ml
的核酸溶液。

②荧光光度法：
荧光染料
DAPI
可专一性地形成
DNA- DAPI
荧光复合物，其荧光强度与溶液中的核酸含量呈正
比。

适用于低浓度
核酸溶液的定量分析。
（
1-5ng
）

纯度检 测
——
紫外分光光度法：
在
260nm
和
280nm
处测定
DNA
溶液的光吸收，纯的
DNA
，低于此值表明制备
物中 留有蛋白质成份，高于此值表明有
RNA
的残留量。

纯的
DNA< br>的
A
260
与
A
280
之比应在
1.80< br>；纯的
RNA
的
A
260
与
A
280
之比应在
2.0
。
A
260
/A
280
比值是纯度检测的重
要指标。

完整性检测
——
凝胶电泳法：
基因组
DNA
电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；
总
RNA
电泳，观测各条带的含量，提示是否存在
RNA
降解；如加样槽中存在 条带，可能是
DNA
污染。

DNA
的保存：
①短期保存：
4
℃
/-20
℃存放于
TE
（
Tris-HCl< br>和
EDTA
）缓冲液中。
TE
缓冲液的
pH
与
DNA
贮存
有关，
pH
为
8
时，可减少
DNA< br>脱氨反应，
pH
低于
7.0
时
DNA
容易变性。
②长期保存：
TE
缓冲液中
-70
℃保存数年；在
D NA
溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌的污染。

RNA
的保存
:< br>①
RNA
可溶于
0.3mol/L
的醋酸钠溶液或双蒸水，在
-70
℃保存；②
RNA
可溶于
70%
的乙醇溶液或
去离子 的甲酰胺溶液中，可在
-20
℃保存；③
RNA
如果以
DEPC（焦碳酸二乙酯）可以抑制
RNA
酶对
RNA
的降
解。

电泳（带电物质在电场中向相反方向电极移动的现象）

①琼脂糖凝胶电泳：
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，
可以形成具有刚性的滤孔，
凝胶孔径的大小决定于
琼脂糖的浓度；
DNA
分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动；
DNA
分子在电泳时，
有电荷效应与分子筛效应；不同
DNA
的分子量大小及 构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同区
带。

影响琼脂糖凝胶电泳的因素：

1.
凝胶的浓度：
根据检测的
DNA
分子大小；


分子大小与构象：
超螺旋
DNA>
开环
DNA>
线状
DNA
；

3.
电泳缓冲液：
TAE
（
40 mol/L Tris-
乙酸、
1 mmol/L EDTA
）
;TBE( 90 mol/L Tris-
硼酸、
1 mmol/L EDTA
）

4.
加
DNA
样品：
<1μg
，指示剂；

5.
电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间

6.
染 色和观察：
EB
染色，在
300nm
波长的紫外下观察，能看到
0. 05μg
的微量
DNA

②聚丙烯酰胺凝胶电泳：
聚丙烯酰胺凝胶是 由
单体丙烯酰胺
(Acr)
和交联剂
N,N
＇
-
亚 甲双丙烯酰胺
(Bis)
在加
速剂
N,N,N
＇
,N
＇
-
四甲基乙二胺
（
TEMED)
和催化剂
过硫酸铵(AP)
作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。

（
分辨率高，
适用于
低分子
DNA
（
1-500bp
）、蛋白质，寡聚核苷酸的 分离和
DNA
的序列分析）

特性：

1.
凝胶透 明，有弹性，机械性能好，化学性能稳定，与被分离物无化学反应，对
pH
和温度变化较稳定；

2.
回收的
DNA
样品
纯度极高
；
3.
无吸附和电渗作用，
若
Acr
纯度高，
操作条件一致，
则< br>样品分离重复性好
；

4.
样品不易扩散，且用量少，其
灵敏 度可达
10
-6
g
；

5.
凝胶孔径可调节，根据 被分离物的分子量选择合适浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；

6.
分辨率高
，尤其在不连续凝胶电泳中，
集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。在同一个
DNA
混合物中，
1bp
与
500bp
也能很好的分离。

第五章
&
第六章
&
第七章

引物：
人工合 成的两段寡核苷酸序列，是与模板某区序列互补的一小段
DNA
片段。一条引物与目的区域一端 的
一条
DNA
模板链互补
,
另一条引物与目的区域另一端的另一条< br>DNA
模板链互补。

基因文库：
通过克隆方法保存在适当宿主中的某 种生物、
组织、
器官
/
细胞类型所有
DNA
片段构成的克隆 集合体。

根据构建方法不同，基因文库分为：①基因组文库
—
全部基因②< br>cDNA
文库
—
含有全部蛋白质编码的结构基因