DNA

2021年2月28日发(作者：会阴长疖子)
DNA
人类基因组
DNA
的提取

【实验目的】

1
、学习人类基因组
DNA
的提取原理和方法。

2
、熟悉应用分子生物学实验常用仪器。


【原理】
< br>哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备
DNA
，除特殊要求外，白血球、肝或脾组织是

最常用的材料。
原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞）
，还必须经过细 胞培养来获得足

够量的细胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮脱落细胞、

发根细胞。

一般真核细胞基因组
DNA
有
107-9bp
，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，
常是采用在
EDTA以及
SDS
等试剂存在下用蛋白酶
K
消化细胞，
随后用酚抽提而 实现的。
这一方法
获得的
DNA
不仅经酶切后可用于
Souther n
分析，还可用于
PCR
的模板。



一、材料

一份提取总
DNA
的细胞或组织





1.5ml
Eppendorf
管、微量移液器与 吸头、
15ml
离心管、三角瓶（
500
或
1000ml
）
。

二、设备


离心机、电子天平、恒温水浴箱、紫外分 光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉或
沸水浴、透射紫外灯。

三、试剂


1
．细胞核裂解液
(STE)
：
0.1 mol/L NaCl
，
10mmol/L Tris-HCl
，
1mmol/L EDTA
2
．
0.8%
（
W/V
）标准琼脂糖；

3
．
0.5×
TBE
缓冲液

4
．其他试 剂：
TE
缓冲液或重蒸水、氯仿
/
异戊醇（
24:1
，V/V
）
、异丙醇或无水乙醇、电泳加样缓冲
液、溴化乙锭（
EB
）

四、操作步骤（酚法抽提染色体
DNA
）

（一）
DNA
的提取

1.
采集口腔粘膜脱落细胞，用舌 头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；
将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，< br>2000rpm
离心
10
分钟，倒掉上清；重复
1
次。

2.

沉淀中加
1ml 1
×细胞核裂解液
(
STE
)
，混匀，再加
350
?
l STE
和
150
?
l 10% SDS
，摇匀，至出现
粘稠透明状。加
10
?
l 20mg/ml< br>蛋白酶
K
，摇匀。
37
℃温箱过夜或
50
℃

3~4
小时。

3
．加等体积饱和酚，轻摇混匀
10
分钟，室温
2000rpm
离心
10
分钟，去除蛋白和
SDS的沉淀。

4.

小心移上清至另一离心管，加等体积氯仿混匀
5
分钟，室温
2000rpm
离心
5
分钟。

5.

小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6.

将上清移入另一离心管中，
沿离心管壁向
DNA
溶液 中加入
2.5
倍体积的无水乙醇，
轻轻摇动离心
管混和至体系完全均一，见白 色絮状
DNA
。用移液器吸头挑出
DNA
沉淀，在新配制的
70%< br>乙醇洗
二次，室温干燥
5
分钟，再将
DNA
溶于
20 -100
?
l TE
中，测
OD
值。

7. TE
溶解的
DNA
，在
4
℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2
倍体积无水乙醇置
-70
℃保存。

2.

电泳鉴定

取样品
1
μ
l
、电泳缓冲液
5
μ
l
、
6
×加样缓冲液
1
μ
l
（ 含溴酚蓝和二甲苯青
FF
指示剂及甘油）
，混
匀，在
0.8%
琼脂糖凝胶上进行水平板微型电泳，用噬菌体
λ
DNA
作为标准。
DNA< br>区带应比较集中，
泳动速度与
λ
DNA
相同或稍慢，证明分子量均
>50kb
。一般见不到泳动速度比溴酚蓝快的
RNA
区
带。
如果
DNA
不成区带，
而是散开分布在
λ
DNA
与 溴酚蓝之间，
则说明
DNA
已经被降解成小分子，
不能再用来进行限制性内切 酶图谱分析。

五、

注意事项

1.

酚抽提时如果上清液太黏，不能和蛋白质分开时，可加入适量
STE
稀释，然后再用酚抽提。< br>
2.

保温可在
45~55
℃
范围内进行。

3.
真核生物的
DNA
分子很大，机械张力极易引起
DNA
分子的断裂，因此 抽提
DNA
时动作不可
过猛；溶液转移次数要尽量减少，而且转移时一定要用粗口径滴 管，

以防机械力（震动）将
DNA
分子打得太碎。

4.

沉淀
DNA
时要小心操作，勿使纤维网断成小丝。

5.

DNA
溶于
TE
溶液时可先浓一点，
发现太 浓时再加些
TE
溶液。
这样能保证
DNA
样品不至于太
稀而 无法使用，一般来讲，
DNA
浓度为
0.4~0.6mg/ml
最为理想。< br>
6.

溶于
TE
溶液中的
DNA
样品比较 稳定，可在
4
℃
冰箱中存放
1
年而不会降解。

DNA
的鉴定及定量

1.
比色法
:

DNA
在
260nm
处有最大的吸收峰，蛋白质在
280nm
处有最 大的吸收峰，盐和小分子则
集中在
230nm
处。
因此，
可以用260nm
波长进行分光测定
DNA
浓度，
OD
值为
1
相当于大约
50μg/ml
双链
DNA
。
如用
1c m
光径，
用

H
2
O
稀释
DNA
样品
n
倍并以
H
2
O
为空白对照，
根据此时读出的
OD
260
值即可计算出样品稀释前的浓度：
DNA
（
mg /ml
）
=50×
OD
260
读数
×
稀释倍数/1000
。


DNA
纯品的
OD
2 60
/OD
280
为
1.8
，故根据
OD
260< br>/OD
280
的值可以估计
DNA
的纯度。若比值较高说
明含 有
RNA
，比值较低说明有残余蛋白质存在。
OD
230
/OD260
的比值应在
0.4-0.5
之间，若比值较高
说明有残余的盐存在 。

用重蒸水将比色杯冲洗干净，用重蒸水或
TE
把提取的样品稀释
100
倍。将紫外分光光度计的
波长设为
260nm
，以重蒸水或
T E
做为对照，测定
OD
值。

OD
260
=
；


DNA
的浓度
=
50 OD
260

稀释倍数
=
。
将波长换成
280nm
及
230nm
，用同一样品再次测定
OD
值：



OD
280
=
；
OD
230
=
；

OD
260
/
OD
280
=
；
OD
260
/
OD
230
=
；


结论：所提取的
DNA

。

2.

电泳鉴定

取样品
1
μ
l
、电泳缓冲液
5
μ
l
、
6
×加样缓 冲液
1
μ
l
（含溴酚蓝和二甲苯青
FF
指示剂及甘油），混
匀，在
0.8%
琼脂糖凝胶上进行水平板微型电泳，用噬菌体
λDNA
作为标准。
DNA
区带应比较集中，
泳动速度与
λ
DNA
相同或稍慢，证明分子量均

>50kb
。一般见不到泳动速度比溴 酚蓝快的
RNA
区
带。
如果
DNA
不成区带，
而是 散开分布在
λ
DNA
与溴酚蓝之间，
则说明
DNA
已经被降 解成小分子，
不能再用来进行限制性内切酶图谱分析。


限制性核酸内切酶切割的原理及方法

1
限制性核酸内切酶的基本知识

①来源及化学本质
:

是识 别
DNA
的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链
DNA
的一类内切酶。

主要是从原核生物中分离纯化出来的。化学本质为蛋白质。

②作用：催化 作用，可用于
DNA
的切割获取目的基因和载体的切割，切割的化学键为磷
酸二酯键。

③作用特点：特异性
,
即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列
,< br>切割特定位点。

④切割方式：错位切
--
产生两个相同的黏性末端， 平切
--
形成平末端。如果是错位切则
将一个基因从
DNA
分子上切 割下来
,
需要破坏
4
个磷酸二酯键
,
同时产生
4< br>个黏性末端，
增加
4
个游离的磷酸基团。

限制性核酸内切酶的分类：

根据限制酶的结构
,
辅因子的需求切位 与作用方式，
可将限制酶分为三种类型，
分别是第
一型（
Type I
）
、第二型（
Type II
）及第三型（
Type III
）
。

切割原理及方法
：

限制性内切酶能 特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的
DNA
序列之内或其附近
的特异位点上， 并切割双链
DNA
。它可分为三类：

Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有 切割和修饰
（甲基化）
作用且依赖于
ATP
的存在。
Ⅰ类酶结合于识 别位点并随机的切割识别位点不远处的
DNA
，而Ⅲ类酶在识别位点上
切割
D NA
分子，然后从底物上解离。

Ⅱ类由两种酶组成：

一种为限制性内切核酸酶（限制酶）
，它切割某一特异的核苷酸序
列；
另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子
克隆中得到了广泛应 用，它们是重组
DNA
的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为
4
至
6
个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如
EcoR
Ⅰ识别六个核苷酸序列：
5'-
G↓AATTC
-3'
）
，有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ 类酶切割位点在识别序列中，
有的在对称轴处切割，产生平末端的
DNA
片段（如Sma
Ⅰ：
5'-
CCC↓GGG
-3'
）
；有的切< br>割位点在对称轴一侧，
产生带有单链突出末端的
DNA
片段称粘性末端，
如
EcoR
Ⅰ切割
识别序列后产生两个互补的粘性末端。

示意图：

5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'

3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'