菌种的分离与纯化

2021年2月27日发(作者：外阴红肿瘙痒)

接种、分离纯化和培养技术




一、接种



将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。

１、接种工具和方法



在实验室或工厂实践中，
用得最 多的接种工具是接种环、
接种针。
由于接种要求或方法的不同，
接种针的
针尖 部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培
养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。
（图３－３
）



图３－３

接种和分离工具

1
．接种针
2.
接种环
3.
接种钩
4.5.
玻璃涂棒
6.
接种圈
7.
接种锄
8.
小解剖刀







常用的接种方法有以下几种：



１）
划线接种

这是最常用的接种方法。
即在 固体培养基表面作来回直线形的移动，
就可达到接种的作用。
常用的接种工具有接种环，接种针 等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。



２）三点接种
< br>在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的
三点，让 它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。



３）穿刺接种

在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺 接种时，用的接种工具是接种
针。
用的培养基一般是半固体培养基。
它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，
沿半固体培养基中心向管底作
直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能 运动，则在穿刺线周围能够生长。



４）
浇混接种
< br>该法是将待接的微生物先放入培养皿中，
然后再倒入冷却至
45
°
C< br>左右的固体培养基，
迅速
轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合 适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。



５）涂布接种

与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用
涂布棒 在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。



６）液体接种

从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中， 用移液管将菌液接
至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。< br>


７）注射接种

该法是用注射的方法将待接的微生物转 接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫
苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些 疾病。



８）活体接种

活体接种是专门用于培养病毒 或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生
物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个 动物；
也可以是某个离体活组织，
例如猴肾等；
也可以是发育的
鸡胚。接种的 方式是注射，也可以是拌料喂养。

２、无菌操作



培 养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌
苔 或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。



实验台面不论是什么材料，
一律要求光滑、
水平。
光滑 是便于用消毒剂擦洗；
水平是倒琼脂培养基时利于
培养皿内平板的厚度保持一致。
在实 验台上方，
空气流动应缓慢，
杂菌应尽量减少，
其周围杂菌也应越少越好。
为 此，必须清扫室内，关闭实验室的门窗，并用消毒剂进行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量。



空气中的杂菌在气流小的情况下，
随着灰尘落下，
所以接种时，
打开培养皿的时间应尽量短。
用于接种的
器具必须经干热或火焰等灭菌。
接种 环的火焰灭菌方法：
通常接种环在火焰上充分烧红
（接种柄，
一边转动一
边慢 慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料
或菌体，迅速地接种到新的培养基上。
（图３－４）
然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰 灭菌，复原。
不要直接烧环，
以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。
平板接种时 ，
通常把平板的面倾斜，
把培养皿的
盖打开一小部分进行接种。
在向培养皿内 倒培养基或接种时，
试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，
试管或瓶口
应倾斜一下在火焰 上通过。






图３－４

斜面接种时的无菌操作

(1)
接种灭菌
(2)
开启棉塞
(3)
管口灭菌
(4)
挑起菌苔
(5)
接种
(6)
塞好棉塞

二、分离纯化



含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（
Mixed culture
）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于
一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（
Pure
culture
）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为
纯的培养物。得到 纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。

１、倾注平板法



首先把微生物悬液通过一系列稀释，
取一定量的稀释液与熔化好的保持在
40~50< br>°左右的营养琼脂培养基
充分混合，
然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，
待 凝固之后，
把这平板倒置在恒箱中培养。
单一细胞经过
多次增殖后形成一个菌落，取单 个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。（图３－５，
a
）


图３－５

倾注平板法（
a
）涂布平板法（
b
）图解

1.
菌悬液
2.
熔化的培养基
3.
培养物
4.
无菌水

２、涂布平板法



首先把微生物 悬液通过适当的稀释，
取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，
然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。（图３－５，
b
）

３、平板划线法



最简单的分离微生物 的方法是平板划线法。
用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。
划线的方法
很 多，
常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、
曲线法、
方格法、
放 射法、
四格法等。
（图３－６）
当接种环在培养基表面上往后移动时，
接种环 上的菌液逐渐稀释，
最后在所划的线上分散着单个细胞，
经培养，
每一个细胞长成一个 菌落。（图３－７）

４、富集培养法



富集培养法的 方法和原理非常简单。
我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，
在这些条件下，
所需
要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，
在生长能力方面远远超过其他微生物。
所创造的条件包括选择最
适的碳源、能源、温度、光、
pH
、渗透压和氢受体等。在 相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最