唐山凤凰妇科食品添加剂乳铁蛋白的质量规格要求生产使用工艺和检验方法,食品中该添加剂的检验

2021年2月22日发(作者：毛囊炎的最佳治疗方法)

资料四


乳铁蛋白



食 品添加剂的质量规格要求、生产
使用工艺和检验方法，食品中该添
加剂的检验方法或相关情况说 明






内蒙古伊利实业集团股份有限公司

一、乳铁蛋白质量规格要求

（一）感官指标

项目

色泽

滋气味

组织状态

标准

淡粉红色粉末。

具本产品特有的味道，无异味

均匀、细密粉末，无吸潮、无结块。
正常视力下无可见杂质。

检测方法

取
5
克被测样品置于一洁净
的白色搪瓷皿中，在 自然光
线下用肉眼观察其色泽和
外观形态及其滋气味。

（二）理化指标

项目

总蛋白质％

乳铁蛋白占总蛋
白的比例

水分％

灰分％

铁饱和度

pH
颗粒度要求

标准

≥
95.0
≥
90%
≤
8.00
≤
5.00
5-20%
4.5-6.8
40
目筛分通过率≥
85%
50
目筛分通过率≥
50%
完全溶解，无肉眼溶物

检测方法

GB 5009.5-2010
见本节“二、检验方法”

GB 5009.3-2010
GB 5009.4-2010
见本节“二、检验方法”

检测
2%
水溶液在
20
℃下的
pH
标准筛检测

取
0.2
克乳粉，置于
50
℃、
200
mL
水中，
充分搅拌
2
分钟以上，
静止后观察。

溶解度

（三）微生物、污染物及真菌毒素指标

项目

菌落总数（
cfu/g
）

大肠菌群（
cfu/g
）

金黄色葡萄球菌
（
cfu/g
）

酵母和霉菌（
cfu/g
）

阪崎肠杆菌（
cfu/g
）

沙门氏菌（
cfu/g
）

铅（
mg/kg
）

砷（
mg/kg
）

黄曲霉毒素
M
1
（
?
g/kg
）

标准

≤1000

≤10

≤10

≤50

0/100g
0/25g
≤0.15

≤0.2

≤0.5

检测方法

GB 4789.2-2010

GB 4789.3-2010
平板计数法

GB 4789.10-2010
平板计数法

GB 4789.15-2010
GB 4789.40-2010
GB 4789.4-2010
GB 5009.12-2010
GB/T 5009.11-2003
GB 5009.24-2010
二、检验方法

（一）用反相高效液相层析法测定乳铁蛋白的纯度

1.
样品准备

对粉状乳铁蛋白，称出
20
mg
乳铁蛋白样品，用
MilliQ
水配成
20
mL
，
1
mg/mL
的乳铁蛋白溶液，再通过
0.2
μ
m
的乙酸纤维素膜进行过滤。

2.
材料和试剂

（
1
）
MilliQ
水（超纯水
18 megohm resistivity
）

（
2
）
95%
的乙腈
(
氰化甲烷
)
（
HPLC
级）

（
3
）
1%
的三氟乙酸（
TFA
）

2.1
缓冲液准备

（
1
）缓冲液
A
：
100% MilliQ
水

把
1 L MilliQ
水装在
1 L
的
SCHOTT
瓶中。

（
2
）缓冲液
B
：
95%
的乙腈

分别量取
50
mL
MilliQ
水和
950ml
乙腈。把二者混合，通过
0.45
μ
m
的滤
膜进行过滤。储存在
1 L
的
SCHOTT
瓶中。

（
3
）缓冲液
C
：
1%
的三氟乙酸

用移液管量取
25
mL
三氟乙酸放入
200
mL
MilliQ
水中，用
MilliQ
水补至
250 mL
。转移到
250 mL
的
SCHOTT
瓶中储存。

3.
仪器设备

（
1
）水基线体系控制和获得数据的设备 （
Empower
）

（
2
）水
2695
分离组件和
2487
双
λ
吸收检测器

（
3
）反相高效液相层析柱
---Alltech prosphere C4 300A 150mm ×
4.6mm,
with Alltech All- guard Guard 7.5 ×
4.6mm.
4.
高效液相层析的测量方法

4.1
注射体积

50
μ
L
已过滤的乳铁蛋白样品或空白液注入柱中供分析。

4.2
梯度表


时间

（
min
）

0.00
10.00
11.00
13.00
15.00
流速

（
mL/min
）

1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
成分

% A
73.3
35
18
18
73.3
% B
16.7
55
72
72
16.7
% C
10
10
10
10
10
曲线


6
6
6
6
4.3
温度

柱子温度
=35°
C
样品温度
=10°
C
4.4
检测

在波长
280 nm
处检测乳铁蛋白，乳铁蛋白的洗脱时间大约
9.7
分钟。

5.
过程与计算

5.1
用
Empower
软件，用样品的层析谱减去空白溶液。

5.2
结合整个样品的层析谱，算出全部蛋白的含量。然后结合乳铁蛋白的高峰区
算出乳铁蛋白的百含 量（以蛋白质为基数）
。

5.3
用下面的计算公式计算乳铁蛋白的百分含量（干重）
：

乳铁蛋白的百分含量
(
干重
)=[
蛋白含量
/(100 -
水分
)]×
乳铁蛋白的百分含量

其中：蛋白含量是用凯氏定氮法测定的蛋白含量

乳铁蛋白的百分含量是用高效液相层析法测定的乳铁蛋白含量

（二）乳铁蛋白铁饱和度的测定

1.
原理

通过向乳铁 蛋白水溶液中逐渐加入等分量的三价铁离子溶液直至乳铁蛋白
铁饱和。
该过程中乳铁蛋白铁饱和 度的变化在
465 nm
分光光度计下进行检测，
当
吸光值不再变化的时候说 明乳铁蛋白已经完全饱和。

2.
试剂

2.1

FeCl
3
.6H
2
O
2.2

NTA (
氨三乙酸
)
2.3

NaH
2
PO
4
.H
2
O
2.4

Na
2
HPO
4
.12H
2
O
2.5

NaHCO
3

2.6

NaOH

2.7

NaCl
3.

溶液的配置

3.1
配置含有
10 mM
氯化铁和

0.1 M HCl
的溶液：

（
1
）在
100 mL
容量瓶中分别加入：

- 0.83 mL 37%
的
HCl
- 0.270 g
的
FeCl
3
.6H
2
O (
准确称量
)
（
2
）加蒸馏水至
100 mL
刻度处

3.2
配置
40 mM Na- NTA
溶液：

在
100 mL
容量瓶中分别加入
:
- 0.764 g
的
NTA
-
加入大约
20 mL
去离子水

-
缓慢加入
1 M
的
NaOH< br>溶液来溶解
NTA
粉末
(
以形成可溶的
NTA
钠盐< br>)
-
将
1M
的
NaOH
逐滴加入，每加入一滴并 充分混合直至
NTA
完全溶解

3.3
配置含有
5mM FeCl
3
.6H
2
O
和
20 mM NaNTA
的溶液


-
将等量（各
20 mL
）的
3.1
和
3.2
溶液混合

-
用
10 M
的
NaOH
溶液将溶液的
pH
值调至< br>4-6
之间（例如：
4.5
）
，但要注意
尽可能少的将溶液稀 释）

3.4 0.1M NaHCO
3
的配置

将
8.401 g
的
NaHCO
3
加入
1
升蒸馏水中。

3.5

2%
乳铁蛋白水溶液的配置

-
将
0.8 g
乳铁蛋白粉末溶解于
40 mL
蒸馏水中

-
搅动直至完全溶解

4.

铁饱和度的测量

可以用所配置溶液来测定
pH
值和在
600
nm
时的透光率，溶液必须经过
0.45
μm millipore
过滤器过滤

-
将
1mL
乳铁蛋白溶液注入比色皿

-
加入
1.5 mL 0.15M NaCl
和
200 μ
L
的
0.1 M
的
NaHCO
3
溶液

-
在
465 nm
下测量溶液的吸光值

-
加入
10 μ
L
等量的溶液
3.3
。
每加一次，< br>充分混合并在
465 nm
下测量吸光值，
直到吸光值变为恒定，也就是说乳铁蛋白趋于饱和。

5.

结果的表达

以纵坐标为吸光值，横坐标为等量三价铁离子浓 度作图。直线
(1)
为当乳铁
蛋白趋于饱和时的吸光值。直线
(2)
为以初始乳铁蛋白吸光值为原点到铁饱和时
吸光值的连线。将直线
(2)
反向延长使其 与横坐标交汇。