乙肝分型指导原则发布稿

2021年2月19日发(作者：母子乱沦)
附件


乙型肝炎病毒基因分型检测试剂

技术审查指导原则


本指导原则旨在指导注册申请人对乙型肝炎病毒（
Hepatitis
B Viru s
，
HBV
）
基因分型检测试剂注册申报资料的准备及撰写，
同时也 为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。

本指导原则是对乙型肝炎病毒基因分型定性检测 试剂的一
般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，
若不适用，
需 具体阐述理由及相应的科学依据，
并依据产品的具
体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化 。

本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，
不涉
及注册审批等 行政事项，
相关人员应在遵循相关法规的前提下使
用本指导原则。

本指导原 则是在现行法规、
标准体系及当前认知水平下制定
的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的 不断发展，本指导
原则相关内容也将适时进行调整。

一、范围

我 国
2006
年乙型肝炎流行病学调查表明，我国
1
—
59
岁 一般
人群乙型肝炎表面抗原（
Hepatitis B surface antigen，
HBsAg
）携
带率为
7.18%
，
5
岁以 下儿童的
HBsAg
仅为
0.96%
。据此推算，我
国现有的慢性< br>HBV
感染者约
9300
万人，
其中慢性乙型肝炎患者约
20 00
万例；
由于不同的乙型肝炎病毒基因型对现有药物治疗可能
—

1

—
—


存在不同的治疗响应，
乙型 肝炎病毒分型基因检测在慢性乙型肝
炎患者治疗中的作用正被越来越多人所关注。

根 据
HBV
全基因序列异质性≥
8
％的界线，可将其分为不同
的基因型 。目前，已鉴定的
HBV
基因型有
A
—
I
九种，基因型与< br>血清亚型之间的关系已被清晰论证。
基因序列的单个核酸的变化
即可能改变血清亚型，< br>但血清亚型不能反映基因的差异。
通过对
HBV
全序列分析发现，在不同基因型 之间
S
区段异质性最大，而
型内
S
区段的异质性最小，
从而 也可以根据
S
区基因序列异质性≥
4
％的标准区分不同的基因型。
在 此基础上，
发展了一系列简单、
准确的分型方法，
推动了
HBV
基因 型的流行病学及临床相关研究。

基于现阶段研究，在我国
HBV
以
C
型和
B
型为主。
HBV
基因
型与疾病进展和干扰素α治疗 效果有关。与
C
基因型感染者相比，
B
基因型感染者较早出现乙型肝炎
e
抗原（
hepatitis B e antigen
，
HBeAg）
血清学转换，
较少进展为慢性肝炎、
肝硬化和原发性肝
细胞癌；并且< br>HBeAg
阳性患者对干扰素α治疗的应答率高于
C
基
因型；
A
基因型患者应答率高于
D
基因型。其他基因型与疾病谱
的关系还未有特殊发 现。
但是，
由于基因型分布不均衡和样本大
小的影响，
还需要作多中心大样本 的研究方能进一步了解基因型
与疾病谱之间的关系。





HBV
基因型的分布具有明显的地理学特点，大体上如下：

A< br>基因型主要流行于美国及北欧国家；
B
和
C
基因型主要分布
在 亚洲及远东地区；
D
基因型在世界各地均有发现
,
但主要分布于
地中 海地区；
E
基因型仅限于非洲；
F
基因型则分布在中美洲；
G
、
H
、
I
及
J
型基因型的地理分布尚不清楚。随着时间的 推移，新的
—

2

—
—


基因型可能会被陆续发现。

HBV
基因分型检测试剂是指利用包括分子生物 学相关方法
在内的核酸检测技术，
以
HBV
基因序列为检测靶标，
对 人血清、
血浆等样本中的
HBV
不同基因型进行体外定性检测的试剂。结
合临 床表现和其他实验室指标，
可作为乙型肝炎感染者临床诊疗
的辅助指标之一。


本指导原则适用于基于实时荧光
（
polymerase chain r eaction
，
PCR
）方法的
HBV
基因分型检测试剂，其他方 法学的定性检测
方法可参照本指导原则，
但应根据产品特性确定其中具体内容是
否适用 ，
如不适用，
应另行选择符合自身方法学特性的技术要求
或评价方法。
本指导 原则适用于进行产品注册和相关许可事项变
更的产品。其他未尽事宜（包括产品风险分析资料等）
，应当符
合《体外诊断试剂注册管理办法》
（国家食品药品监督管理总局
令第
5
号）
（以下简称《办法》
）等相关法规要求。

二、注册申报资料要求

（一）综述资料

综述资料主要包括产品预 期用途、
产品描述、
有关生物安全
性的说明、
研究结果的总结评价以及同类产 品上市情况介绍等内
容，
其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学及不同基因
型 检出能力等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同
类产品之间的主要区别。
若尚无同类 产品批准上市，
则应详细对
该产品的有效性及安全性进行论述，说明理论依据。

提交的资料应符合《办法》
和
《关于公布体外诊断试剂注册

—

3

—
—


申报资料要求 和批准证明文件格式的公告》
（国家食品药品监督
管理总局公告
2014
年第
44
号）的相关要求。

（二）主要原材料研究资料

应提 供主要原材料如引物、
探针、
企业参考品的选择与来源、
制备过程、
质量分析 和质控标准等相关研究资料。
若主要原材料
为企业自己生产，
其生产工艺必须相对稳定 ，
并提交工艺验证报
告；如主要原材料购自其他供货商，
应提供的资料包括：供货方< br>提供的质量标准、
出厂检定报告，
以及该原材料到货后的质量检
验资料。主要包 括以下内容：

1.
核酸分离
/
纯化组分
（如有）
的主要组成、
原理介绍及相关
的验证资料。


和组分的主要原料（包 括引物、探针、各种酶及其他
主要原料）的选择、制备、质量标准及实验研究资料，主要包括
以 下内容：

2.1
脱氧三磷酸核苷（
dNTP
）

核苷酸的组成成分，包括：
dATP
、
dUTP
、
dGTP
、
dCTP
和
dTTP
，对纯度、浓度、保存稳定性等的验证资料。

2.2
引物

由
一
定
数
量
的碱
基
构
成
的
特
定
序
列
，通
常
采
用
（
Deoxyribonucleic
ac id
，
DNA
）合成仪人工合成，合成后经聚
丙烯酰胺凝胶电泳（
P AGE
）或其他适宜方法纯化。需提供对分
子量、纯度、稳定性、功能性实验等的验证资料。如 为外购，应
提供合成机构出具的合成产物的质检证明，
如
PAGE
电泳结果或
高效液相色谱法（
HPLC
）分析图谱。

—

4

—
—


2.3
探针
特定的带有示踪物（标记物）
的已知核酸片段
（寡聚核苷酸
片段）
，能与互补核酸序列退火杂交，
用于特定核酸序列的探测。
合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳（< br>PAGE
）或其他适宜方法纯化，
在
5
’
-
端
(
和
/
或
3
’
-
端
)
进行标记 ，并经
HPLC
或其他适宜方法
纯化，
纯度应达到
HPLC
纯。
应提供合成机构出具的合成产物的
质检证明，
如
HPLC
分析图 谱，
应对探针的分子量及标记的荧光
素进行核实，并进行功能性试验验证。

2.4
酶

DNA
聚合酶，
应具有
DNA
聚合酶活性，
无核酸内切酶活性，
具热稳定性，
如：
94
℃保温1
小时后仍保持
50%
活性；
尿嘧啶糖
基化酶（
UNG
）
，具有尿嘧啶糖基化活性，无核酸外切酶及核酸
内切酶活性，应对酶活性有合理验证 。
如使用其他工具酶，
应提
供其详细的研究资料。

2.5
核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无
DNase
和
RNase
污染。

2.6
企业内部参考品及试剂内对照（质控品）
：

由于乙型肝 炎病毒不易培养，
制备相应的参考品及质控品时，
参考品设置建议采用灭活病毒的血清
/
血浆。并且参考品及质控
品与被测临床样本在整个试验过程中应保持相同的检测方式。

企业内部参考品以及质控品设置必须客观合理，
能够充分评
价产品的质量。
应采用金标准或其他方法对企业内部参考品以及
质控品中物质成分进行确认。

2.6.1
阳性参考品及阳性质控品

—

5

—
—



阳性参考品应包含试剂盒所能检测的所有基因型
（所有的单
基因型以及所有的重组基因型）
，每个基因型应设置不同浓度水
平 ，应能满足验证产品性能的需要，
至少设置两个浓度水平
（弱
阳性、中或强阳性）；常见基因型（如
B
型、
C
型）阳性参考品
设置建议采用灭活病 毒的血清
/
血浆。其他基因型阳性参考品设
置可采用模拟临床样本。
对于阳性 参考品的获取方式建议使用金
标准的方法或同类方法或者其他能证明问题的方法进行确认。
< br>阳性质控品应包含目标靶基因，
用于监控整个检测过程，
包
括：核糖核酸提取， 基因扩增和检测。
阳性质控品作为单独检测
过程，用于模拟患者样本，用于与患者样本进行同时 检测。

2.6.2
阴性参考品及阴性质控品

可采用经确认无目标 靶基因的序列的样本。
阴性参考品及阴
性质控品对照物可反映非特异扩增或检测过程，
当不存在目标序
列时不会得到相关信号。阴性参考品设置建议采用灭活的血清
/
血浆。
阴性质控品应参与样本核酸的平行提取，
对假阳性结果进
行质量控制。

2.6.3
灵敏度参考品（检测限参考品）

灵敏度参考品是评价产品检测能 力的重要工具，
对于定性产
品来说，其设计的合理性显得非常重要。在基因型设置方面，
应
包括试剂盒所包含的所有基因型。
在浓度设置方面，
应采用核酸
定量的方 法对该参考品进行定量检测，明确被测物的具体量值，
设置浓度应接近产品最低检出限。

2.6.4
精密度参考品

精密度参考品应反映产品检测的重复性以及重复检测的稳

定性，
该部分参考品应采用临床样本作为精密度参考品，
需包括
—

6

—
—


阴性、弱阳性、中或强阳性三个浓度水平的精密度验证。

2.6.5
内对照（内标）

与目标靶基因平行提取，
扩增；
用于对检测管内抑制物造成
的假阴性结果进行质量控制。
内对照
（内标）
可 采用竞争性或非
竞争性的引物设置。

2.6.6
其他需要注意问题

如单个产品检验原理为两种方法学或多种方法学联合检测
的方法，
应对产品中每种方法 学均设置参考品及质控品，
用于对
不同方法学的质量监控，
例如：
检测原理为
PCR
-
杂交方法联用，
在这种情况下，不仅需在
PCR
环 节设置参考品及质控品对扩增
过程进行质量控制；
同时在基因探针杂交环节也必须设置质控程< br>序对杂交过程进行质量控制。

（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料
< br>基本生产工艺主要包括：配制工作液、
半成品检定、
分装和
包装。
配制 工作液的各种原材料及其配比应符合要求，
原材料应
混合均匀，
配制过程应对
pH
、
电导率等关键参数进行有效控制。

生产工艺研究的资料应能对反应体 系涉及到的基本内容，
如
样本类型、样本用量、试剂用量、反应条件、校准方法、质控方
法、稳定性和有效期，提供确切的依据，主要包括以下内容：

1.
主要生产工艺介绍，可以图表方式表示。

2.
反应原理介绍。

3.
基因位点选择、
PCR
方法学特性介绍。


提 取纯化方法优化，建议包含纯化步骤，内标、质
控品均应全程参与提取纯化，
不建议采用煮沸法 进行
DNA
提取。

—

7

—
—


5.
确定最佳
PCR
反应体系的 研究资料，包括酶浓度、引物
/
探针浓度、
dNTP
浓度、阳离子浓度、样本 量、加样量及反应体
积等。

6.
确定
PCR
各阶段温度、时间及循环数的研究资料。

7.
对于基线阈值（
threshold
）和阈值循环数（
Ct
）确 定的研
究资料。

8.
不同适用机型的反应条件的对比分析，如果有差异应分别
详述。

如单个产品检验原理为两种方法学或多种方法学联合检测
的方法，
例如：
检测原理为
PCR
方法和基因探针杂交方法联用。
应在上述
1
至
8项基础上完善以下工作：

1.
主要生产工艺及反应原理介绍。

2.
杂交膜条的制备工艺。

3.
确定最佳杂交反应体系的研究资料 ，包括酶浓度、探针浓
度、样本量、加样量及反应体积等。

4.
确定杂交各阶段温度、时间的研究资料。

5.
交叉污染和携带污染研究。

该类产品适用于检测乙型肝炎病毒感染人群 ，
在临床检测中
发现，
部分临床样本会出现高浓度的乙型肝炎病毒载量。
这部 分
临床样本在提取过程中增加了交叉污染及携带污染的可能性。
在
核酸提取过程中，从 而导致假阳性的结果。

如产品配套采用自动提取设备提取
DNA
，
在携带污染试验中，
建议将高浓度阳性
（病毒浓度至少不低于
10
8
IU/mL
）
样本与阴性
样本在同一待提取反应板中连续交替排列并应进行不少于5
轮上
—

8

—
—

< br>述提取研究。建议试验使用的高阳性样本水平应接近该产品检测
能力的上限。以邻近高阳性样本的 阴性样本的阴性结果对比未邻
近高阳性样本的阴性结果，评估携带和交叉污染的影响。

如产品检测原理中涉及开管检测过程，
如自动化膜条杂交仪，
应参照该项要求进行验证。
（四）分析性能评估资料

企业应提交在产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能 验证
的研究资料，包括具体研究方法、内控标准、实验数据、统计分
析等详细资料。
如 有相应的国家参考品，
应在分析性能评估阶段
采用国家参考品对产品性能进行验证。
建 议着重对以下分析性能
进行研究：

1.
阳性
/
阴性参考品符合率

所有基因型别的阳性参考品 均应按要求检出阳性，
考虑到浓
度梯度的不同，应对各水平阳性参考品设置相应
Ct< br>值的限制；
阴性参考品应按要求检出为阴性。

2.
最低检测限（分析灵敏度）

建议采用
95%
（
n
≥
20
）的阳性检出率作为最低检测限确定
的标准，
应明确各基 因型的最低检出限。
申报试剂应在最低检出
限或接近最低检出限的病毒浓度对说明书描述的所有 基因型进
行验证。

3.
分析特异性

3.1
交叉反应

用于
HBV
DNA
分型检测试剂交叉反应验证的病原体种类
主要考虑以下几方面可能性：

—

9

—
—


3.1.1< br>核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状
的其他病原体。

3.1. 2
申报产品中不同基因型以及乙型肝炎病毒其他基因型
对被检测基因型的影响。对于难以获得的 基因型
,
可采用针对该
基因型构建的质粒或其他基因工程产品进行交叉验证。

3.1 .3
建议用高浓度的病原体对乙型肝炎病毒核酸阴性样本
进行交叉反应的验证。
申请人 应提供所有用于交叉反应验证的病
毒和细菌的来源、种属
/
型别和浓度确认等试验资料 。

3.2
干扰物质

潜在的干扰物质主要包括：
内源性干扰物质和外源性干扰物
质。

3 .2.1
内源性干扰物质：样本中常见干扰物质对检测结果的
影响，如血红蛋白、甘油三酯、胆 红素等。

3.2.2
外源性干扰物质：常用抗凝剂，临床常用抗病毒药物
如 ：干扰素、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定等对
检测结果的影响。

3. 2.3
建议在病毒的检测临界值水平对每种干扰物质的干扰
影响进行检测。
干扰物浓度 的分布应覆盖人体生理及病理状态下
可能出现的物质浓度。
应注明不同干扰物质对被检测物质无 干扰
的最高限值。
对于不易收集的干扰物质浓度样本可使用临床模拟
样本进行调节。< br>
4.
精密度



精密度的评价方法并无统一的标 准可依，
可根据不同产品特
征或企业的研究习惯进行，前提是必须保证研究的科学合理性。—

10

—
—


具体实验方法可 以参考相关的国外或国内有关体外诊断产品性
能评估的文件进行。
企业应对每项精密度指标的评 价标准做出合
理要求，
如标准差或变异系数的范围等。
针对本类产品的精密度
评价主要包括以下要求：

4.1
用于精密度评价的样本浓度水平应至少包含阴性、弱 阳
性和强阳性三个水平。

4.2
合理的精密度评价周期，
例如：< br>为期至少
20
天的连续检
测，每天至少由
2
人完成不少于2
次的完整检测，从而对批内
/
批间、日内
/
日间以及不同操作 者之间的精密度进行综合评价。
如有条件，
申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间精
密度进行评价。

5.
基因混合型的研究

该部分研究主要 包括两个目的：
一是申报试剂检测不同浓度
混合型的能力。申请人应设置不同浓度比例的混合型 进行验证。
二是申报试剂在判读结果时，
是否能够有效区分基因重组型和基
因混合型。
申请人应设置不同浓度的基因重组型与不同混合比例
的基因混合型进行验证。

因理想的不同浓度比例基因混合型样本在临床单位中难以
收集，
申请人可以使用临床模拟样本 进行验证。
该部分样本建议
用核酸测序明确样本中包含的所有基因型序列，
同时应使用 核酸
定量的方法确定不同基因型的浓度。

如申报产品的结果判读无法有效区分基因混 合型与基因重
组型，应在产品说明书中进行注明。


核酸分离纯化

—

11

—
—


病毒
DNA
提取主要有以下目的：富集目的基因浓度、保证
目的基因序列的完整性、增加
PCR
模板溶液均一性、去除
PCR
抑制物，是决定
PCR
成败的重 要因素之一。企业应对核酸提取
的环节做详细的验证。

（五）阳性判断值或参考区间确定资料

阳性判断值确定资料主要指对核酸检测的Ct
值进行确认，
建议申请人对申报产品用于结果判断的临界值予以确认。
参考值
范围研究资料样本来源应考虑不同年龄、型别、
地域等因素，
尽
可能考虑样本 来源的多样性、
代表性。
如存在参考值灰区，
应提
供灰区的确认资料。
如采用其他方法对阳性判断值进行确认研究，
应说明这种方法的合理性。
对于此类试剂，正常人群及其他患病
人群中一般不应检出
HBV
基因型。

（六）稳定性研究资料

稳定性研究资料主要涉及两部分内容，
申报试剂的稳 定性和
适用样本的稳定性研究。前者主要包括实时稳定性（有效期）
、
运输稳定性、< br>开瓶稳定性及冻融次数限制等研究，
申请人可根据
实际需要选择合理的稳定性研究方案。
稳定性研究资料应包括研
究方法的确定依据、
具体的实施方案、
详细的研究数 据以及结论。
对于实时稳定性研究，
应提供至少
3
批样品在实际储存条件下保
存至成品有效期后的研究资料。

应对样本稳定性进行研究，
主要包括室温保 存、
冷藏和冷冻
条件下的有效期验证，
可以在合理的温度范围内选择温度点
（ 温
度范围）
，每间隔一定的时间段即对储存样本进行全性能的分析
验证，
从而 确认不同类型样本的效期稳定性。
适于冷冻保存的样
—

12

—
—