如何排毒-
乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测标准操作程序
1.
目的：明确乙肝病毒 核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量
的检测。
2.
适用范围：
2.1
适用于进行乙肝病毒核酸定量检测的检验人员。
2.2
适合仪器：
LightCycler
型核酸扩增荧光检测仪
2.3
方法原理：采用
PCR
方法结合荧光探针的扩增技术
2.4
样品要求：血清
3.
职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。
4.
试剂来源：中山大学达安基因股份有限公司
HBV DNA
荧光
PCR
检测试剂盒。
5.
质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒
6.
标准操作：
6.1
试剂准备（在试剂准备区操作）
6.1.1
将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻
（
Taq
酶为液态试 剂，
临用前取出，
用后立即放回
冰格）
，完全融解后混匀。
6.1.2
根据当次实验标本量，
取出相应试剂总的需求量于一管中
（其余随即放回原温度保存）
，
如所需要的管数为
n (n=
标本数
+1
管阴性对照
+1
管阳性对照
+1
管临界阳性对照
+4
管阳性参
控品
)
（定性检测无需做阳性参控品）
，
取
PCR
反应管，转移至样本制备区。
6.2
样本制备及加样（在标本制备区操作）
6.2.1
取血清标本
4 0ul
，或阴阳性对照标准品各
10ul
（强阳性标准品使用前加入稀释液
9 0ul
混匀）
，加等量
DNA
提取液打匀，
（提取液内含不溶于水的 物质，取样时需用加样器充分混
匀后吸取。
如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后填满吸头的 现象，
可先用洁净无污染的
剪刀将吸头嘴部剪去一截）
。沸水浴
10
分钟，转至
4
℃静置
8-12
小时以保证病毒颗粒充分
裂解。
6.2.2 10000rpm
离心
5
分钟，取上清液
2ul< br>直接加入到
PCR
反应管中，
6000rpm
离心数秒。
6.2.3
将各反应管带入
PCR
仪。
6.3
PCR
扩增（在扩增区操作）
按仪器使用说明或标准操作程序操作。
扩增条件如下：
93
℃→
2
分钟预变性
93
℃
30
秒
→
55
℃
60
秒（
40
个循环）
6.4
结果判断：
6.4.1
2
个阴性对照的
Ct
值应无数值，
1
个强阳性对照的
Ct
值 应小于等于
30
，
1
个临界阳
性对照的
Ct
值应大 于阳性对照的
Ct
值，并小于等于
38
，否则实验视为无效。
6.4.2
4
个阳性参控品的基因拷贝浓度的对数值为横坐标，
以其实际测得的
Ct
值为纵坐标，
作标准曲线，标准曲线的拟合度
R
应大于等于
0.990
，否则应视为实验无效。
定量结果分析：
上 述两项质控标准均满足时，
可对样品进行定量分析。
分析数据时，根据标
准曲线自动计 算未知标本的相应基因拷贝浓度。若发现有标本
Ct
值小于
15
，须将其剔除 此
次结果分析，该标本稀释后再测直至其
Ct
值大于
15
。
6.5
报告
6.5.1
定量结果判断
检测样本中
HBV-DNA
≥
1
×
103
拷贝数< br>/ml
（
copies/ml
）时，按实际检测结果报告；
检测样本中
HBV-DNA<1
×
103
拷贝数
/ml（
copies/ml
）时，均报告“低于检测下限”
。
6.5.2
报告的签发依据检测结果报告程序。
7.
支持性文件：
7.1
《乙型肝炎病毒核酸扩增荧光检测试剂盒》说明书（中山大学达安基因股份有限公司）
7.2
检测结果报告程序。
7.3
LightCycler
型核酸扩增荧光检测仪
本记录归档周期
1
年保存期限
5
年
管理编号：
生化检测流程记录表
实验日期＿＿年＿＿月＿＿日
本表使用说明：
①各项目执行后在相应的方框内打√。②实验室内的温度为１８-
２８℃，湿度
５０－７０％为合格范围。③实验室清洁、消毒按
SOP
文件执行。④本表保存
在归档文件夹中，存放文件柜中保存
2
年。⑤日立
76 00
生化分析仪中检验结果
保存计算机中，保存
2
年。
前 期准备
□记录室内温度＿＿＿湿度＿＿＿□冰箱温度：冷藏＿＿＿冷冻＿
＿＿
□仪器在校准有效期内（校准之日起
1
年），开机，仪器工作状况：正常
□。
□检查清洗液□
清洁样品针、试剂针、搅拌棒、清洗头□
异常：记录（包括故障及纠正方法）
保养记录：
□检查仪器试剂量，记录添加试剂量
试剂名称
模块
添加量
试剂生产厂家批号
□
实验纯水，记录阻值：＿＿＿＿
操作者
：＿＿＿
＿
检测记录
１、中文报告录入操作者＿＿＿＿
２、英文项目录入操作者＿＿＿＿
３、
质控批号：
＿＿＿＿
＿＿＿＿
室内质控物来源＿＿＿＿，
4
、审核质控结果：在控□；失控□；失控记录（包括纠正措
施）
失控记录：
纠正措施：
实验结果审核：发现不符合项记录＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿，无□。
审核者：＿＿＿＿＿
实验后消毒记录
５、实验后：□
填写记录
□
清洁地面
□
消毒实验台面及器具
□打开紫外线灯，紫外线灯照射记录
灯
1
照射时
间
灯
1
照射累计时间
灯
2
照射时
间
灯
2
照射累计时间
注：灯
1
＝血液分离室紫外线 灯（东）；灯
2
＝血液分离室紫外线灯
（西）
6
、□
按ＳＯＰ文件处理废弃物
操作者：
＿＿＿＿
HBV-- DNA
荧光定量基因检测过程记录表
实验日期：
_______
年
____
月
____
日
SLAN6.0
保存文件名：
____________
1
实验前：
□
打开通风设备
□
温度
______
□相对湿度
________
试剂准备区
（
1
区）
○
试剂：厂家：
________________________________
批号：
_______________________
本次实验扩增试剂：数量：
_____________
人份
试剂存量
:_____________________
人份
②试剂配制过程记录
:
□其它；
③实验后次保养：
□
填写记录
□
冰箱的常规维护
□清洁地面
□
用
1
：
1000优氯净、
75%
酒精消毒实验台面、打开紫外线车照射
45
分钟
□处理废弃物
□
打开紫外线灯照射
45
分钟
□
关闭通风设备
标本处理区
（
2
区
）
1
实验前：
□打开通风设备
□
温度
________
□
相对湿度
_______
○
室内质控物：
来源
___________________
质控浓度
:______________copies/ml
定量阳性标准品浓度：
□
10
4
□
10
5
□
10
6
□
10
7
②
标本处理过程：取待测血清
____
个、阳性室内质控品
___
个、阴性对照
___
个各
100ul
至
1.5ml
离心管中
→< br>向离心管加入
100ulDNA
浓缩液混匀
12000rpm
离心10
分钟
→
去上清，
沉淀加入
20ul
提取 液、
混匀
→
10
0
℃
干浴
10
分钟
→
12000rpm
离心
5
分钟
→
向
____
个
PCR
反应管中分别加入处理过的样本、阳性室内质控、阴性对照和阳性梯度标准品各
2ul
，盖紧管盖，
6000rpm
离心1
分钟。
③
实验后次保养：
□
填写记录
□冰箱的常规维护
□
加样器的常规维护
□离心机的常规维护
□
恒温器的常规维护
□安全柜的常规维护
□
清洁地面
□用
1
：
1000
优氯净、
75%
酒 精消毒实验台面、打开紫外线车照射
45
分钟
□打开紫处线灯照射
45
分钟
□
处理废弃物
□
关闭通风设备
（
3
扩增分析区
区）
1
实验前：
□
打开通风设备
□
温度
________
□相对湿度
_______
○
②
产物扩增过程：
□
将
PCR
反应管置于扩增仪上相应位置，扩增时间< br>____
小时
____
分
□
设定扩增参数：预变性
____
℃
____
分钟，第一步扩增
___ _
℃
____
秒
→
___
℃
____
分钟
____
个循环，
第二步扩增
____
℃
____
秒
→
____
℃
____
秒
____
个循环
③测试所得标准值：
Y
轴截距：
_________
斜率：
__________
相关系数：
____________
阈
值：
__________
④
室内质控结果：
结果：
____________copies/ml
填写室内质控记录、描质控图
结果是否在控：
□是
□否
⑤
实验后次保养：
□
填写记录
□
电脑的常规维护
□
SLAN6.0
的常规维护
□清洁地面
□用
1
：
1000
优氯净、
75%
酒精消毒实验台面、打开紫外线车照射
45
分钟
□打开紫处线灯照射
45
分钟
□处理废弃物
□关闭通风设备
操作者：
____________
审核者：
__________
______
年
____
月
____
日
细菌内毒素检查法标准操作规程
目的：
建立细菌内毒素检查的基本操作，为细菌内毒素检查人员提供正确的操作
如何排毒-
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