李军民Freeβ-HCG综述

2021年2月13日发(作者：肚子大怎么减肥)
游离β人绒毛膜促性腺激素定量检测试剂盒


（化学发光法
)








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游离β人绒毛膜促性腺激素定量检测试剂盒

（化学发光法
)
第三部分

综述资料

一、

产品预期用途

1.

Free
β
-HCG
及其临床诊断

绒毛膜促性腺激素（
hCG）是由胎盘绒毛膜滋养层合体细胞分泌的糖蛋白激素，
分子量约为
39KD
，含有 α和β两个亚基。可分规则
HCG
、缺口
HCG
、规则游离α
亚基、
规则游离β亚基和缺口游离β亚基多种形式，
hCG
在怀孕后
6-8
天内出现在血
清中，
并在最后一次月经之后
50-80
天内达到最大值。β亚基是成簇的
6
个基因编码，
但其中仅有两个在胎盘中得到转录与表达
[1,2]
。

大多数染色体非整倍体胎儿能引起母体血
HCG
水平 的改变
,
因而可用检测母体
血清
HCG
浓度来筛查染色体数目异常的 遗传疾病
,
如
Down
综合征或
21-
三体综合征
,
以减少先天性缺陷患儿出生。这已成为产前筛查的一项重要指标。
Free
β-HCG
比
HCG
更具有分辨性，
且游离β
-HCG
在 产前血清筛查中具有稳定性好，
灵敏度高的优
点，
可同时用于母体孕早期和孕中期唐氏 综合症的筛查。
调查数据表明唐氏综合症在
新生儿中的发病率约为
1/600
～
1/800
，占小儿染色体病的
70%
～
80%
。据估计 我国目
前大约有
60
万以上的唐氏综合征患儿，
每年出生的唐氏综合征患儿可 多达
27
万例左
右，平均每
20
分钟就有
1
例唐氏 综合征患儿出生。而游离β
-HCG
在产前血清筛查
中具有稳定性好，灵敏度高的优点 ，可同时用于母体孕早期和孕中期筛查。因此，母
体血清中人绒毛膜促性腺激素游离β亚单位的检测对产 前
Down
氏综合征患儿筛查
有非常重要的意义，
且产前及时诊断染色体异常 儿并终止妊娠，
对降低出生缺陷、
提
高人口素质将发挥十分重要的作用。

β
-HCG
可用于异位妊娠。在异位妊娠诊断中，
Free
β-HCG
有
100%
的灵敏度
和
79%
特异度，在有症 状的患者中血清
Free
β
-HCG
测定可识别异位妊娠
,
有利于密
切随访和减少输卵管妊娠破裂的危险性。

滋养细胞疾病患者血清中
Free
β
-HCG
大幅度升高。
Free
β
-HCG
还 可用来区
分部分性葡萄胎和完全性葡萄胎
,
以及葡萄胎和侵蚀性葡萄胎。
< br>羊水穿刺是诊断唐氏综合症的金标准，
但由于羊水穿刺是种侵入性的操作，
给患
者带来痛苦，
在实际临床工作中往往由于多种原因而难于实施。
而血清学检测具有无
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创伤性及敏感性的临床诊断指标取 代羊水穿刺检查评价进行孕早期和孕中期的胎儿
神经管缺陷或唐氏综合症的初步筛查，具有重要实用价值 。




我们选题的目的就是研制高质量的唐氏筛查的血清学指标 化学发光定量测定试剂
盒，建立一种科学、方便、经济的血清学
Free
β
- HCG
检测方法，为临床诊断提供重
要依据。

2.

Free
β
-HCG
的特性

2.1 Free
β
-HCG
的分子结构

绒毛膜促性腺激素（
hCG
）是由胎盘绒毛膜滋养层合体细胞分泌的糖蛋白激素，
分子量约为
39KD
，含有α 和β两个亚基。可分规则
HCG
、缺口
HCG
、规则游离α亚
基、规 则游离β亚基和缺口游离β亚基多种形式
[1]
。
hCG
的α
-亚基的分子量约为
13000
，是
92
个氨基酸的糖肽，在
52
和
78
位天冬酰胺残基
N-
连接寡糖侧链，链中含有
10< br>个
Cys
残基，形成
5
个链内二硫键
(7-31
、< br>1O
一
6O
、
28
—
82
、
32< br>—
84
、
59
—
87)
维持结
构稳定。hCG
的α
-
亚基的生物特性和其他垂体糖蛋白激素，如卵泡刺激素（
F SH
）
、
黄体生成激素
（
LH
）
、
促甲状 腺激素
（
TSH
）
的α
-
亚基相同。
β
-
亚基的分子量约
15000
，
是
145
个氨基酸组成，链中含有
12
个
Cys
残基，
形成
6
个链内二 硫键
(93
—
1 OO
、
26
—
110
、
23
—
72
、
9-57
、
34 88
、< br>38
—
90)
，这些二硫键的存在决定了
hCG
的二级结构，
N
端连接
的寡糖附在
13
和
30
位天冬酰胺残基上 ，
121
，
127
，
132
，
138
位< br>4
个丝氨酸连接
(O
端连
接
)
寡糖键结合在
C
端肽上
[2]
。
O-
连寡糖主要有两种形式，
三糖和六糖 。
β
-
亚基为
HCG
特异性链，可被单克隆抗体检测，是一个较好的 标志物。

2.2 Free
β
-HCG
的生物学功能

Free
β
-HCG
是现在唯一知道的可以同时用于一期和二期筛查的标记 物。
怀有唐
氏综合症胎儿的母血中
Free
β
-HCG
水 平高于健康孕妇，而在怀
18
染色体单体异常
胎儿母血中戏剧性的降低。
唐氏 综合症母血
Free
β
-HCG
平均水平为
1.9MoM
，
健康
母血为
1.0MoM
。由于完整的
hCG
水平在DS
患者母血中只有
1.3MoM
，不能明显鉴
别出
DS
患者。

2.3
产品预期用途

大多数染色体非整倍体胎儿能引起母体血
Free
β
-HCG
水平 的改变
,
因而可用
检测母体血清
Free
β
-HCG浓度来筛查染色体数目异常的遗传疾病
,
如
Down
综合征
或< br>21-
三体综合征
,
以减少先天性缺陷患儿出生。如果胎儿患有唐氏综合症，则 孕中
期母体血清中
HCG
的游离β亚基水平会在怀孕中期增长超过
100%[ 2,3]
。

2
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这已成为产前筛查的一项重要指标。
Free
β
-HCG
具有分辨性强，
且
Free
β
-HC G
在产前血清筛查中具有稳定性好，灵敏度高的优点，可同时用于母体孕早
期和孕中期唐氏综合 症的筛查。

Free
β
-HCG
也可用于异位妊娠的诊断，异位妊娠的患者血清
Free
β
-HCG
浓度大概为
28-180IU/L,
β
-HCG
倍增时间延长
,
可达
3
～
8d
。

滋养细胞疾病患者血清中
Free
β
-HCG
大幅度升高。
当血中可测到高浓度的
Free
β
-HCG
时高度提示滋养细胞疾病。
Free
β
-HC G
还可用来区分部分性葡萄
胎和完全性葡萄胎
,
以及葡萄胎和侵蚀性葡萄胎。

本产品的预期用途为诊断唐氏综合症患儿，异位妊娠和滋养细胞疾病等疾病。

二、产品描述


1.

化学发光免疫分析
20
世纪
70
年代中期
Arakawe
首次报道用发光信号进行 分析检测，即利用发光的
化学反应（
chemiluminescence
，
CL
）和生物反应（
bioluminescence
，
BL
）分析 超微
量物质，
特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。
这一方法，
从 实验室的稀
有技术过渡到临床医学的常规检测手段，
近十年来获得了很大的发展。
化学 发光免疫
分析
（
chemiluminescence immunoassay，
CLIA
）
以其灵敏度高
（
attomole
即< br>10-18mol
）
，
快速（几秒钟内产生化学发光信号，有的情况下信号可持 续几小时）
，简便，测试中
不使用有害的试剂，因此成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法 之一。

我公司采用的化学发光免疫分析方法，是利用酶催化发光底物，则发光底物发生
化学反应并释放出大量的能量，
产生激发态中间体。
这种激发态中间体，
当其回到稳
定的基态时，
可同时发射出光子，
利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，
该光
量子产额与样品中的待测物质的量成正比。
由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。

与几种传统的免疫学检测方法对比而言，无论从灵敏度、检测时间、线性范 围、
试剂的稳定性、有无环境污染等方面对比，化学发光法的优势都显得极为突出。

化学发光法作为一种
20
世纪
90
年代才迅速兴起的一种新型检测技术，除具有检
测方法简单快速的优点之外，
还具有灵敏度高，
检测范围宽等优点，因此越来越多的
受到临床诊断实验室的关注，
是近年来该领域的研究热点。
而我公 司经过多年来的深
入研究，
已经开发建立了化学发光免疫检测平台，
这就为下一步各种 检测试剂盒的建
立打下了坚实的基础。

3
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2.

检测原理

游离β人绒毛膜促性腺激素定量检测试剂盒（化学发光法）是基于酶联免疫 分析
技术和化学发光检测技术建立的检测体系。
试剂盒应用双抗体夹心法原理，
将β< br>-HCG
单克隆抗体包被微孔反应板作为固相载体，
辣根过氧化物酶
（
HRP
）
标记游离β
-HCG
单克隆抗体作为酶结合物，采用一步法反应模式 。在微孔板各孔中分别加入标准品、
样本后，然后加入酶结合物，则标准品、样品中所含的
Fr ee
β
-HCG
将会与之形成
抗体
-
抗原
-抗体
-
酶复合物。
洗去未结合的酶结合物后，
加入化学发光底物，
其发光强
度与
Free
β
-HCG
含量成正比。利用标准品所建 立的标准曲线，可以计算出样本中
Free
β
-HCG
的含量。

双抗体夹心法原理如下图所示：


3.

主要原材料来源

本试剂盒涉及到的主要原材料均为外购产品，来源如下：

Free
β
-HCG
抗原：

纯化高值尿样，经
DELFIA
时间分辨荧光法甲胎蛋白
/
游离< br>hCG
β亚基双标试剂盒测定其靶值为
13421ng/ml
。

β
-HCG
包被抗体：购自依美诺生物

HRP- Free-
β
-HCG
单抗：购自依美诺生物

4.

主要生产工艺过程










4
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4.1
包被板的生产





包被液配剂记录








封闭液
/
保护液配剂记录

包被
（
100
μl
/
孔，
2
～
8
℃过夜）

包被液配制

各种原材料
（β
-HCG
包被抗体，
发光微孔板）

原材料质检记录

微孔板质检记录











封闭前检验记录

封闭
（纯化水洗板
两次，
150
μ
l/
孔封闭液，室温放置
3h
保护
（甩去封闭液，
150
μ
l/
孔保护液，
室
温放置
3h
包被板制备记录

< br>干燥
（抽干后拍板，
湿度
45%
以下，温
度
18～
26
度，干燥







16h
r
以上）

装


袋

半成品检验记录

入半成品库

5
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（化学发光法
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4.2
酶结合物的配制与分装









酶结合物配剂记录





















6

各种原材料
（
Free
β
-HCG
酶标抗体，试剂瓶）

原材料质检记录

试剂瓶质检记录

酶稀释液配制

加入酶标抗体

酶结合物

分装前检验记录

分装记录

分装

半成品检验记录

入半成品库