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荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素
B2
的含量
一．实验目的
1.
学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素
B2
的分析原理。
2.
掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄糖粉中维生素
B2
的方法。
二．实验原理
1.
荧光光度法原理
（
1
）
常温下，
处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发 态
分
子，
激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的 最低振动能级，
再以辐射跃迁的
形式回到基态，
发出比吸收光波长长的光而产生荧光。
在稀溶液中，
荧光强度
IF
与物质的浓度
c
有以下的关系：
I
F
?
2
.
303
?
I
0
?
bc
当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：
I
F
?
Kc
这是荧光光谱法定量分析的理论依据。
（
2
）荧光分析法的特点：
a.
与紫外
-
可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。
b.
选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。
c.
所需试样量少、操作方法简便。
（
3
）荧光光谱
激发光谱：固定测量波长
(
选最 大发射波长
)
，化合物发射的荧光强度与照射光波
长的关系曲线。
激发光谱曲 线的最高处，
处于激发态的分子最多，
荧光强度最大。
发射光谱：固定激发光波长
(
选最大激发波长
),
化合物发射的荧光强度与发射光
波长关系曲线。
固定发射光波长进行激发光 波长扫描，
找出最大激发光波长，
然后固定激发光波
长进行荧光发射波长扫描，
找出最大荧光发射波长。
激发光波长和发射荧光波长
的选择是本实验的关键。
（
4
）荧光分析仪器
常用的荧光分析仪器由激发光源、
单 色器、
液槽、
检测器和显示记录器五部分构
成，如下图所示：
I
0
显示器
检测器
光源
单色器
I
0
液槽
I
f
单色器
I
荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：
a.
荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；
b.
荧光分析仪器有两个单色器，
能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂
散光干扰。
2.
荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素
B2
的含量
维生素
B
2
（又叫核黄素，
VB
2
）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为 ：
OH
HO
HO
HO
H
H
3
C
N
H
H
H
H
N
O
NH
H
3
C
N
C
O
维生素
B
2
易溶于 水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，
光照易分解，对热稳定。维生素
B2
溶液在
430
～
440
nm
蓝光的照射下，发出绿
色荧光，荧光峰在
525
nm
。维生素
B
2
在
pH=6
～
7
的溶液中荧光强度最 大，在
pH=11
的碱性溶液中荧光消失，所以可以用荧光光度法测维生素
B
2
的含量。
多维葡萄糖中含有维生素
B
1
、
B< br>2
、
C
、
D
2
及葡萄糖，其中维生素
C和葡萄
糖在水溶液中不发荧光，维生素
B
1
本身无荧光，在碱性溶液中用 铁氰化钾氧化
后才产生荧光，维生素
D
2
用二氯乙酸处理后才有荧光，他们都 不干扰维生素
B
2
的测定。
维生素
B
2
在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的
荧光比核黄素的荧光强的多，
故 测维生素
B
2
的荧光时溶液要控制在酸性范围内，
且在避光条件下进行。
三．仪器与试剂
970CRT
荧光光度计
5 mL
吸量管
1
只，
2 mL
吸量管
1
只，
50 mL
容量瓶
7
只
10.0
μ
g< br>·
mL-1VB2
标准溶液（置阴暗处保存）
，冰乙酸（
AR
）
，
多维葡萄糖粉试样
四、实验步骤
970CRT
荧光光度计的基本操作
1.
打开氙灯，
再 打开主机，
然后打开计算机启动工作站并初始化仪器，
预热
30min
2.
仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：
3.
样品测定
(1)
标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：
在
6
个干净的
50 ml
容量瓶中，分别吸取
0.50
、
1.00
、
1.50
，
2.00
，2.50
和
3.00
维生素
B
2
标准溶液，各加入2.00 ml
冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。得到不同浓度
的溶液分别是：
0.1
，
0.2
，
0.3
，
0.4
，
0.5，
0.6ug/ml
的维生素
B
2
溶液，从稀到浓
测量 系列标准溶液的荧光强度。
(2)
未知试样的测定
:
称取
0.15-0.20 g
多维葡萄糖粉试样
,
用少量水溶解后转入
50
ml
容量瓶中，加
2.00
ml
冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测 定标准系列时相同的条件，平行测量
其荧光强度
3
次
4
、退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯
五．实验结果及数据处理
2
的激发和发射波长
（
1
）固定发射波长（
526nm)
扫描吸收波长
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