手上长老年斑质粒DNA及λDNA的酶切分子生物学实验

2021年2月2日发(作者：右后背疼是怎么回事)
质粒
DNA
及λ
DNA
的酶切、连接、转化及重组子的筛选、鉴定< br>
一、实验目的

1
、学习和掌握限制性内切酶的特性

2
、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法

3
、掌握利用
CaCl2
制备感受态细胞的方法

4
、学习和掌握热击法转化

的原理和方法

5
、掌握α互补筛选法的原理

6
、学习用试剂盒提取重组质粒
DNA
的方法

7
、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法

二、实验原理
:
外源
DNA
与载体分子的连接即为
DNA
重组技术，这样重新组合的
DNA
分子叫做重组子。重组的
DNA
分子式在
DNA
连接酶的作用 下，有
Mg2+
、
ATP
存在的连接缓冲系统中，
将分别经限制性内 切酶酶切酶切酶切酶切的载体分子和
外源
DNA
分子连接连接连接连接起来。将重组质 粒导入感受态细胞中导入感受
态细胞中导入感受态细胞中导入感受态细胞中，
将转化后的细胞在 选择性培养基
选择性培养基选择性培养基选择性培养基中培养，
可以通过αααα互补筛选法< br>互补筛选法互补筛选法互补筛选法筛选出重组子，
并可通过酶切酶切酶切酶切电
泳电泳电 泳电泳及
PCRPCRPCRPCR
检验检验检验检验的方法进行重组子的鉴
定。
1.

重组子的构建

酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱 ，选用的限制性内切酶不能目的基
因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源 工体
DNA
时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或
者 噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单
酶切法， 即只用一种限制性内切酶切割目的
DNA
片段，酶切后的片段两端将产
生相同的黏性末 端或平末端，
再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组
子时，除了形成正常的 重组子外，还可能出现目的
DNA
片段以相反方向插入载
体分子中，或目的
D NA
串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重
新环化的现象。
单酶切法简 单易行单是后期筛选工作比较复杂。
各种限制性内切
酶都有去最佳反应条件，
最主要的 因素是反应温度和缓冲液的组成，
在双酶切体
系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高 盐，先低温后高温”的原则进
行反应。

（要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切 的
DNA
数量要适当。另外，
酶切反应的规模也取决于需要酶切的
DNA的量，以及相应的所需酶的量。可以
适当增加酶的用量，
但是最高不能超过反应总体积的< br>10%
，
因为限制性核酸内切
酶一般是保存在
50%
甘油的缓 冲液中，
如果酶切反应体系中甘油的含量超过
5%
，
就会抑制酶的活性。）< br>
连接反应总是紧跟酶切反应，外源
DNA
片段与载体分子连接的方法即
DNA
分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和
DNA
连接酶催化完成的。< br>DNA
连接酶催化两双链
DNA
片段相邻的
5
’
-< br>磷酸和
3
’
-OH
间形成磷酸二酯键。
在分子克隆中最有用的
DNA
连接酶是来自
T4
噬菌体的
T4DNA
连接酶，它可以
连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体
DNA
和外源
DNA< br>的摩尔数之比控
制在
1:
（
1~3
）之间，可以有效地解决< br>DNA
多拷贝插入的现象。反应温度介于
酶作用速率和末端结合速率之间，一般是
16
℃，用常用的连接时间为
12-16h
。

2.

感受态细胞的制备及质粒转化

构建好的重组
DNA
转入感受态细胞 中进行表达的现象就是转化。能进行转
化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA
片段实现转
化的生理状态，
它决定于受体菌的遗传特性，
同时与菌 龄、
外界环境等因素有关。
人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取
DNA的能力，
或人为地将
DNA
导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用 热击法，电穿孔法等。能
否实现质粒
DNA
的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用 的受体细胞一般是
限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
< br>目前常用的感受态细胞制备方法有
CaCl2
法，
制备好的感受态细胞可以加入
终浓度为
15%
的无菌甘油，
-70
℃可保存半年至一年。经过CaCl2
处理的细胞细
胞膜通透性增加，允许外源
DNA
分子进入。在 低温下，将携带有外源
DNA
片
段的载体与感受态细胞混合，
经过热击或电穿 孔技术，
使载体分子进入细胞。
进
入受体细胞的外源
DNA
分子通过 复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。
将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重 组子。本实验以
5
α菌株为受体细胞，用
CaCl2
处理，使其处于感受态， 然后将重组后
的
PUC19
质粒在
42
℃下热击
90s，实现转化。

3.

重组子的筛选鉴定

重组
DNA
转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组
DNA
分
子， 一般仅有少数重组
DNA
分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细
胞在吸纳重 组
DNA
分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受
体菌细胞混杂在一 起。
再者，
在这些被转化的受体细胞中，
除部分含有我们所期
待的重组
DNA
分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源
DNA
片段形 成非期待重组
DNA
分子导入所致。
因此必须使用各种筛选及鉴定手
段区分转 化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组
子。本实验中采用的方法是平板筛选 法电泳筛选法及
PCR
检测方法。

抗药性筛选主要用于重组质粒
D NA
分子的转化子的筛选，而不含重组质粒
DNA
分子的受体菌则不能存活，α互补筛 选法是根据菌落颜色筛选含有充足质
粒的转化子。
质粒
PUC19
携带有氨苄 青霉素抗性基因
（
Ampr
）
,
在含有氨苄青霉
素平板上筛 选转化子。没有导入质粒
PUC19
的受体细胞，在含有氨苄青霉素的
平板上不生长。 质粒
PUC19
进入
5
α后，通过α
-
互补作用，形成完整
的β
-
半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用β
-
半乳糖 苷酶分解培养
基中的乳糖产生有机酸，
pH
降低，培养集中的指示剂变红，转化子的菌 落变红。
不含质粒的
5
α，
没有β
-
半乳糖苷酶活性，不能利用培养集中的乳糖产
生有机酸，而是利用培养集中的有机碳源，不使培养基
pH降低，在不含有氨苄
青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。重组后的载体
DNA
因为目的基因的插
入位点在
PUC19
乳糖利用基因内部，不能形成α
-互补作用，所以也不能利用培
养集中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白 色菌落。

挑选在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落，
通过扩增培养。
因为 许多菌落
存在假阳性情况，在氨苄青霉素培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体
DNA菌落，也可能是载体自连后发生突变的菌落，所以还要鉴定转化子中重组
质粒
DNA
分子的大小，可将重组的载体
DNA
提取出来，进行后续的酶切、电
泳检验。

也以提取的重组质粒为模板，利用现有的引物，进行那个
PCR
扩增，检测
个噢偶见的质粒是否是所期望的重组质粒。

4.

PCR
技术

PCR
（
Polymerasechainr eaction
）即聚合酶链式反应，其原理类似于
DNA
的
体内复制，又叫 做“体外基因扩增”。反应体系包括：模板
DNA
、寡核苷酸引
物、
Mg2+
，
4
种脱氧核糖核酸（
dNTP
）、
DNA
聚合酶 和合适的缓冲体系。反应
基本程序包括
DNA
变性、引物复性及引物延伸三个基本过程 。这三个反应构成
一个循环，
反复进行。
每一轮循环扩增的产物可作为下一轮扩增反应 的模板。
理
论上每一轮循环可使
DNA
数量增加一倍，反复
30次，特异
DNA
序列片段以指
数方式可扩增
105~106
。< br>通过此技术可以使非常微量的
DNA
产生大量的
PCR
产
物， 因此这个技术是一项在体外大量生产目的基因的技术。

现在普遍通用的是一种从水生嗜热杆菌 中提取的
TaqDNA
聚合酶，而且大
大提高了扩增片段的特异性、
灵敏性和 扩增效率。
反应中用的引物有两段，
一条
称为上游引物或者正向引物，
一条称 为下游引物或者反向引物。
引物的设计十分
重要，在设计时应遵循以下原则：长度一般为
18
到
24
个碱基；
G+C
的百分含
量在
40% ~60%
；单条引物内部避免含有二级结构，避免形成引物二聚体；最好
以
1
到
2
个
G
或
C
碱基开始或结束；引物的
5
’端可以被修饰，但是
3
’端绝对
不能进行任何修饰，而且引物的
3
’端要避开密码子的第三位。模板的浓度不能
太大，
dNTP
的浓度为
2.5 mmol/L
，金属离子的浓度为
1.5mmol/L
，缓冲液为
pH
为
7.2~8.0
的
Tris
—
HCl
溶液。

二、实验材料：

1.
菌株：
5
α

2.
培养基：
LB
培养基、麦康凯培养基（加入氨苄青霉素）

3.
试剂材料：

酶切反应：
（
DNAPUC19
质粒，酶切
10
×
buffer
，
Hind
Ⅲ
,< br>重蒸水，λ
DNA
。）

连接反应：
（酶切后的
DN APUC19
质粒和λ
DNA
，
连接
10
×
buf fer
，
T4
连接酶，
重蒸水。）
感受态细胞的制备：
（< br>0.1MCaCl2
）转化：（连接液和感受态细胞，
0.1MCaCl2
，冰 块。）

重组菌的挑选、检验：
试剂盒（含有
RnaseA
的溶液Ⅰ ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，
HBbuffer,DNAwashingbuffer
，
elu tionbuffer
）
,
酶切后的
DNAPUC19
质粒，
试剂盒
抽提的
DNA
，酶切
10
×
buffer
，
Hind
Ⅲ
,
重蒸水，琼脂糖，
TAE
缓冲液。上样缓< br>冲液，
EB
染液。

PCR
检测：
10
×< br>PCRbuffer,dNTP,
模板，引物
1
，引物
2
，水 ，
TaqDNA
聚合酶，
琼脂糖，
TAE
、溴化乙锭（
EB
）

4.
仪器器材：
20
、
200
、1000ul
的枪和枪尖，
1.5ml
的
Ep
管，恒温培养箱， 水浴
锅，平板，三角瓶，试管，接种环，牙签，酒精灯，火柴，冰箱，离心机，电泳
槽，紫外仪 ，
PCR
扩增仪

三、实验步骤