全口义齿图片《分子生物学》实验报告-植物基因组DNA的提取及其定性定量分析

2021年2月2日发(作者：霉菌阴道炎)


《分子生物学》实验报告


实验一


植物基因组
DNA
的提取及其定性、定量分析

【实验目的】


通过本实验学习利用
CTAB
法从植物组 织中提取
DNA
并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分
光光度法对
DNA
进 行定性定量分析。

【实验原理】


CTAB(
十六烷基 三甲基溴化铵
)
是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度
下
(< br>大于
0.7 M NaCl)
，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物 组织进行研
磨，从而破碎细胞。然后加入
CTAB
缓冲液将
DNA
溶 解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去
除蛋白，最后经乙醇沉淀得到
DNA
。

琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化
DNA
片段的常用技术。
把
DNA样品加入到一块包含电解
质的多孔支持介质
(
琼脂糖凝胶
)
的样 品孔中，
并置于静电场上。
DNA
分子在高于等电点的
pH
溶液中带 负电荷，在电场中向正极移动。
DNA
分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分
子筛 效应。由于糖
-
磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链
DNA
几乎具 有等量的净
电荷，因此，在一定的电场强度下，
DNA
分子的迁移速度取决于分子筛效 应，即
DNA
分子
本身的大小和构型。
DNA
分子的迁移速度与相对 分子质量的对数值成反比关系，分子量小
的
DNA
分子比分子量大的
DNA< br>分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也
可以分离相对分子质量相同，
但构型不同的
DNA
分子，
超螺旋质粒
DNA(cccDNA)
泳动 最快，
其次为线状
DNA(L DNA)
，最慢的为开环质粒
DNA(ocDNA)
。

核酸分子< br>(DNA
或
RNA)
由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在
260
nm
波长处有特异
的紫外吸收峰，
其吸收强度与核酸的浓度成正比，
这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了
基础。
1 OD
260
相当于
dsDNA 50 μg/mL
，
ssDNA 33 μg/mL
和
ssRNA 40 μg/mL
。可以此来计算
核酸样品 的浓度。
紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，
还可通过测定
260 nm
和
280 nm

1

的紫外线吸收值的比值
(A260/A280)
估计核酸的纯度，若
DNA
的
A260/A280
比值高于
2.0
，
则可能有
RNA
污染，低于
1. 8
则有蛋白质污染。

【仪器、材料与试剂】


一、仪器及耗材

离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪 、凝胶成像分析系
统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器
(1 0
、
100
、
1000 μL
量程各一支
)
、
100 mL
或
250 mL
锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或
parafilm
、吸头、
1.5 mL EP
管、
PE
手套和乳胶手套。

二、药品

三羟 甲基氨基甲烷
(Tris)
、
CTAB(
十六烷基三甲基溴化铵
)< br>、
β
-
巯基乙醇、氯仿、苯酚、
乙醇、氯化钠
(NaCl)< br>、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸
(EDTA)
、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、
核 酸染料。

三、试剂

1.

2×
CTAB buffer
【
1
】

2.

3.

4.

5.

70%
乙醇
【
2
】

【
3
】
RNaseA (
天根
)

【
4
】
0.5×TBE
缓冲液
(
工作浓度
)< br>6×loading buffer
【
5
】


6.


核酸染料
(
赛百盛
)
7.


DNA marker DL 2000(Takara)
8.


酚
/
氯仿

(1:1, V/V)
【实验步骤】


1.
取约
100 mg
新鲜的拟南芥嫩叶放入
1.5 mL EP
管，
在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。

2.
加入
0.6 mL 2×
CTAB
提取液
（用前加入
0.2
﹪的巯基乙醇）
，
混匀，
65
℃

水浴
30 min
，
每
10 min
颠倒混匀一次。

3.
取出离心管，冷却后加入
0.6 mL
酚氯仿混合液，混匀。

4. 11,500 rpm
室温离心
8 min(
若没离好可重复一次
)
。

5.
将上清液
(
约
400
μL
)
转移到另一新的
1.5 mL
离心管中。

6.
加入与上清等体积的氯仿，混匀，
11,500 rpm
离心
8 min
，取上清
(
约
350

μL
)
。

7.
加入
600
μL
无水乙醇，上下颠倒混匀，
-80
℃放置
30 min
。


2
【
6
】


8. 4
℃，
15,800 rpm
离心
20 min
，弃上清。

9. 1 mL 70
％乙醇
(
预冷< br>)
洗涤沉淀
2
次，
上下颠倒几次，
不能
vortex
，
7,000 g
离心
3 min
，
弃上清，风干。

10.
加入
30 μL
无菌水
(
含
20 μg/mL RNase A)
，
37
℃

溶解
DNA 30 min
。

11.
取
5 μL DNA
样品进行琼脂糖凝胶电泳检测：


(1)
制备琼脂糖凝胶

称取
0.3 g
琼脂糖，放入三角瓶中，加入
30 mL 0.5×
TBE
缓冲液，置微波 炉中加热至
完全熔化，取出摇匀，则为
1
％琼脂糖凝胶液。

(2)
胶板的制备

①

取有机玻璃内槽，
洗净，
晾干，
用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好
（一
定封严，不能留缝隙）
， 形成一个模具。

②

将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。

③

待琼脂糖凝胶液冷却到
60
℃

左右时，
加入核酸染料
1.5
μL
，
摇匀，
缓缓 倒入有机玻
璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）
。

④

室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下
30-45 min
）
，垂直轻拔梳子，取下胶带，将
凝胶及内槽放入电泳槽中。

⑤

加入
0.5× TBE
电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约
1 mm
。

(3)
加样

在点样板或
parafilm
上混合
DNA
样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不
小于
1×
。用< br>10 μL
微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将
DNA marker分别加至
样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，
应更换一个加样头，
以防污 染，加样时勿碰坏
样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）
。


(4)
电泳

①

接通电泳槽与电泳仪的电源 ，
DNA
片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移
动）
。
DN A
的迁移速度与电压成正比，
但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，
因此，< br>最高电压不超过
5V/cm
。

②

当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿
1-2cm
处，停止电泳。

③

紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作）
，采用凝胶成像系统拍照保存。

12.
紫外分光光度法测定
DNA
浓度及纯度：


3

(1)
用
0.1×TE
对待测
DNA样品按
1:20
或合适的倍数稀释。

(2)
开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现
“instrument
Ready”
时，进入核酸测定窗口。

(3)
调零。先用
0.1×TE
缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击
“set ref”
键，仪
器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。

(4)
吸
70
μL
已稀释的
DNA
样品转入石 英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很
少，
可以用
5-
7 μL
的石英样品杯。
点击
“enter”
键，
仪器即进入分析状态。
窗口同时显示
260
nm
和
280 nm
处的光密度（
OD
值）及
A260/A280 nm
和
A280/A260 nm
的比率以及
DNA
样
品的浓度等。

(5)
打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干后，再加
入下一个待测样品。< br>
(6) DNA
纯度：以
A260/ A280
比值来反映。当
A260 /A280
比值
<1.8
时，说 明样品存在蛋
白质或酚等杂质，
可采用平衡酚
/
氯仿
/
异戊 醇再抽提除去蛋白质或用氯仿或乙醚抽提去除残
留酚，再用无水乙醇沉淀，
TE
溶解后 再测定。当
A260/A280
比值
>2.0
，说明样品存在
RNA
污染，可以用
RNA
酶处理样品去除
RNA
。


实验结果与分析

1. 1%
的琼脂糖凝胶电泳检测拟南芥基因组
DNA
1%
的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的
DNA
5
μl
样品， 电泳结果如图所示
C
组
电泳结
果
如
图
所
示


4



有
DNA
条带出 现，表明已经成功提取到了拟南芥的基因组
DNA
。



样品的
OD
检测

检测
OD
值

C1
：浓度
:
1061.7 ng/
OD260/OD280
：
1.87
表明
：
C1
接种
DNA
质量良好。
（如下图所示）


5







C2
：
浓度
:
1017.6ng/


OD260/OD280
：
1.86
表明
:
C2
接种
DNA
质量良好。
（如下图所示）


6