苏州肛肠医院质粒DNA的小量提取DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告

2021年2月2日发(作者：激光美白医院)
质粒
DNA
的小量提取及
DNA
琼脂糖凝胶电泳


一、前言

质粒

质粒是附加到细胞中的非细胞的或核区原有的能够 自主复制的
较小的
DNA
分子
(
即细胞附殖粒、又胞附殖粒
)
。大部分的质粒虽然
都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为）中，乃至于植物的等胞器中。
然而，
1984
年，
在
Streptom yces coelicoler()
等以及在
Borrelia
hermsii(
赫氏蜱疏螺旋体
)
等原核生物中，又相继
发现线形质粒。

天然质粒的
DNA
长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒
天然存在于这些生物里 面，
有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至
于数种的质粒同时存在。质粒的套数在细胞里从单 一到数千都有可
能。有时有些质粒含有某种抗药基因
(
如大肠杆菌中就有含有抗基因< br>的质粒
)
。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能
力，乃至于 在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在与
否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因 工程最常见的运载
体。

质粒在细胞内的复制一般有两种类型
:
紧密 控制型和松弛控制
型。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它
也不能复 制，
通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子，
如
F
因子。
后者的 质粒在整个细胞周期中随时可以复制，
在每个细胞中有许多拷
贝，一般在
20
个以上，如

Col E1
质粒。在使用蛋白质合成抑制剂
-
氯霉素 时，细胞内蛋白质合成、染色体
DNA
复制和细胞分裂均受到
抑制，紧密型质粒复制停 止，而继续复制，可由原来
20
多个扩增至
1000-3000
个，此时质粒
DNA
占总
DNA
的含量可由原来的
2%
增
加至< br>40-50%
。

把一个有用的目的
DNA
片段通过重组DNA
技术，送进受体细
胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。
细菌质粒是重组< br>DNA
技术中
常用的载体。
质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。
质粒还带有
某些遗传信息，
所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。
其自我复制能力及所携带的遗传信息在重组
DNA
操作，如扩增、筛选过程中都是极
为有用的。< br>
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工
构建的。
与天然 质粒相比，
质粒载体通常带有一个或一个以上的选择
性标记基因
(
如抗生素< br>)
和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识
别位点的多克隆位点序列，
并去掉 了大部分非必需序列，
使分子量尽
可能减少，
以便于基因工程操作。
大多质粒 载体带有一些多用途的辅
助序列，
这些用途包括通过方法肉眼鉴定重组克隆、
产生用于 序列测
定的单链
DNA
、外源
DNA
序列、鉴定片段的插入方向、外 源基因
的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性
:
⑴分子
量 小、多拷贝、松弛控制型
;
⑵具有多种常用的限制性内切酶的单切
点
;
⑶能插入较大的外源
DNA
片段
;
⑷具有两个以上的遗传标记物，
便于鉴定和筛选。⑸对宿主细胞无害。常用的质粒载体大小一般在
1kb
至
10kb< br>之间，如
PBR322
、
PUC
系列、
PGEM
系列 和
pBluescript(
简称
pBS)
等。

质粒的不兼容性

利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，
它们在复制及随后分配到子细胞的
过程中彼此竞争，在一 些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞
中另一种质粒却占上风。
当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，
因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容
性。

琼脂糖凝胶

从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，
剩下的不含磺 酸基团、
羧酸基
团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，
冷 却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。
凝胶的网孔大
小和凝胶的机械强度取决于琼 脂糖浓度。
因此琼脂糖凝胶可作为分子
筛，常用于凝胶层析和电泳。

从琼脂 中除去带电荷的琼脂胶后，剩
下的不含磺酸基团、
羧酸基团等带电荷基团的中性部分，
结构是链状
的聚半乳糖，
易溶于沸水，
冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状
结构的凝胶。凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。
因此琼脂糖凝胶可作为分子筛，常 用于凝胶层析和电泳。

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是用作支持介质的 一种方法。
其分析原理与其他
支持物电泳最主要区别是
:
它兼有
和

电泳

的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到，
大分子物质
在涌动时受到的阻力大，
因此在凝胶电泳中，
带电颗粒的分离不仅取
决于净电荷的性质和数量，
而且还取决于分子大小，
这 就大大提高了
分辨能力。
但由于其孔径相比于蛋白质太小，
对大多数蛋白质来说其微不足道，现广泛应用于的研究中。

蛋白质和核酸会根据
pH
不同带有 不同电荷，
在电场中受力大小
不同，
因此跑的速度不同，
根据这个原理可将其 分开。
的
pH
在
6~9
之间，
0.02~0.05
为最适。常用
1%
的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂
糖凝胶约可区分相差
100 bp
的
DNA
片段，其分辨率虽比低，但它
制备容易，分离范围广。普通琼脂 糖凝胶分离
DNA
的范围为
0.2-20kb
，利用脉冲电泳，可分离高达< br>10^7bp
的
DNA
片段。

DNA
分子在琼脂糖 凝胶中泳动时有电荷效应和。
DNA
分子在高
于等电点的
pH
溶液中 带负电荷，在中向正极移动。由于糖
-
磷酸骨
架在结构上的重复性质，相同数量的双链
DNA
几乎具有等量的净电
荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。


二、实验目的

1.
学习和掌握碱裂解法提取质粒
DNA

2.
学习和掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作。


三、实验原理

1.
质粒
DNA
的小量提取
碱裂解法是根据共价闭合环状质粒
DNA
与线性染色体
DNA
的
变性与复性的差异达到分离的目的。

在强碱性条件下，染色体
DNA
的氢键 断裂，双螺旋结构解开而
变性，质粒
DNA
大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状 的两条
互补链不会完全分离，彼此互相盘绕，仍会紧密地结合在一起。当将
pH
调到中 性并有高浓度盐存在时，变性质粒
DNA
又回复到原来的
结构保存在溶液中，而染色体
DNA
不能复性，相互缠绕形成不溶性
网状结构。通过离心，染色体
DNA< br>与不稳定的大分子
DNA
，蛋白
质
-SDS
复合物等一起沉淀 下来而被除去。
提取的质粒
DNA
再用酚、
氯仿抽提进一步纯化。


琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是最常用的鉴定
DNA
的 方法，它简便易行，只
需少量
DNA
。

琼脂糖是一种天然聚合长链 状分子，可以形成具有刚性的滤孔，
凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

DNA< br>分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。
DNA
分

观 察琼脂糖凝胶中
DNA
的最简便方法是利用荧光染料溴乙锭
（
EB
）
染色，
EB
在紫外灯照射下，
发红色荧光，
本实验使用
Go ldview
。


四、实验器材和材料试剂

1.
实验材料

菌种：含质粒
PET28a
的大肠杆菌

2.
实验试剂：

（
1
）溶液
I
：

50mmol/L
葡萄糖溶液

25mmol/L Tris-Cl (pH8.0)
10mmol/L EDTA (pH8.0)
（
2
）溶液
II
：
0.4mol/L NaOH, 2%SDS
用前两者等体积混合，需新鲜配制

（
3
）溶液
III:3mol/L
的乙酸钾

（

pH4.8
）

3mol/L
乙酸钾
60ml
冰乙酸







11.5ml
水











28.5ml
（
4
）酚
/
氯仿试剂：

V
（酚）：V
（氯仿，含
1/24
异戊醇）
=1:1
（
5
）
TE
缓冲液

10mmol/L Tris-Cl (pH7.4-8.0)
1mmol/L EDTA (pH8.0)
（
6
）
LB
培养基

蛋白胨





10g
酵母浸出粉

5g
NaCl






10g
溶解在
1L
水中，
调
pH
至
7.2
，
1 21℃高压蒸汽灭菌
20min
。