解放军323医院实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析

2021年2月2日发(作者：同仁益健茶)
实验十二


DNA
的限制性内切酶酶切分析


课程名称：生物化学与分子生物学实验课












年级：
2006


专业、层次：临床医学本科


















授课教师：许成山

职称：讲师
































学时：
4
学时

基本教材：自编

《生物化学与分子生物学实验指导》


教学目的与要求：

1
、实现
DNA
的体外重组，鉴定
Bcl-2
重组质粒中的插入片 段。

2
、学会设计构建体外重组
DNA
分子，根据目的基因合理选 择载体与限制性内
切酶以及
DNA
的酶切技术。


大体内容与时间安排：

1
、
DNA
限制性内切酶酶切分析与琼脂糖凝胶电泳的原理







10min
2
、
DNA
琼脂糖凝胶电泳的操作过程（录像）


















5min
3
、
Eco
R
Ⅰ酶切操作步骤的改动注意事项






















5min
4
、学生做实验











































140min

教学方法：
讲授式
+
启发式


教学重点、难点：

重点：
1
、
DNA
限制性内切 酶酶切分析与琼脂糖凝胶电泳的原理

2
、
DNA
限制性内切酶酶切分析的注意事项

难点：
DNA
限制性内切酶酶切分析的原理






一、实验原理

（一）
Eco
R
Ⅰ酶 切重组质粒
Bcl-2
的原理：

限制性内切酶
(restriction endonuclease
，
RE )
是由细菌自己产生的能识别双链
DNA
分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核 酸中的磷酸二酯键的核酸水
解酶。它可分为三种类型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，Ⅱ型酶就是通常所指的
R E
，能识别
双链
DNA
的特异顺序，并在这个顺序内进行切割。它是基因工程 中剪切
DNA
分子的常用工具酶，
被誉为分子生物学家的手术刀。
临床上某些 遗传病是由于基
因的缺失或插入或突变所致，可造成
RE
酶切位点的改变，故当用一定 的
RE
切
割时，其切开的片段
(
分子量
)
大小与正 常人发生差异，即
DNA
限制性图谱发生
改变，据此可达到基因诊断的目的。

实验可选用价格低廉、酶切效果好的
Eco
R
Ⅰ
(
识别位点
G
↓
AATTC)
对
λ
DNA
进行酶切，观察RE
的特定切割作用及其限制性图谱，理论上可产生分子
量分别为
21 226bp
，
7 421bp
，
5 804bp
，
5 604bp
，
4 878bp
和
3 530bp
片段。
< br>本实验是将实验十制备的人
Bcl-2
重组质粒
DNA
作为
E co
R
Ⅰ酶切底物。
人
Bcl-2
重组质粒是
Eco
R
Ⅰ单酶切的
pBluescript
Ⅱ
KS(-)
载体与
EcoR
Ⅰ单酶切的人
Bcl-2
cDNA
重组而成的，大小为
4 861bp
，前者是一种由
pUC19
质粒衍生而来的具有
2
96 1bp
的质粒载体。因此用
Eco
R
Ⅰ酶切则应得到空载
pBlue script
Ⅱ
KS(-)
载体
(2.96kb)
和人
Bc l-2
cDNA
(1.9kb)
两个片段。经琼脂糖凝胶电泳后可较容易鉴定
鉴定该质粒中的插入片段。


（二）琼脂糖凝胶电泳的原理

琼脂糖凝胶电泳是重组
DNA
研究中 常用的技术，
可用于分离，
鉴定和纯化
DNA
片段。
不同大小、不同形状和不同构象的
DNA
分子在相同的电泳条件下
(
如
凝胶 浓度、电流、电压、缓冲液等
)
，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分
离。
凝胶中的
DNA
可与荧光染料
SYBRGreen I
结合，
在紫外灯下可看到亮绿色
荧光条带，籍此可分析实验结果。





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