满足女人彗星实验

2021年2月2日发(作者：河北癫痫病医院)
彗星实验
(Comet assay),
又称单细胞凝胶电泳
(Single cell gel
electrophoresis
，
SCGE),
各种理 化因子作用细胞后引起的
DNA
链的断裂可
用该方法检测
[1
～3]
，并在统计学基础上对损伤程度做出评估
[4]
。本实验
对
Singh
等
[5]
建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。用超净工作台上
的紫外消毒灯
[
可发射波长为
254
nm
的紫外线
(U ltraviolet
，
UV)
，属于
UVC
波段范围
]< br>作为
DNA
损伤的诱导因子
[7
～
9]
，诱导
K562
细胞
DNA
损伤，用改
良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验 系统是否可靠，同时筛选并评价
D
N
A
损
伤
的
分< br>析
指
标
。



1
材料与方法



1.1
细胞

K562
细胞，
来源于第四军医大学免疫学教研室，
37
℃、
5
％

CO2
培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。



1.2
紫外线照射装置

紫外消毒灯
(ZSZ-20
型，
20
W
，天津市紫晶特种
光源有限公司
)
。



1.3
主要试剂和仪器

培养基：
10
％新生 牛血清
(
杭州四季青公司
)
，
90
％
RPMI- 1640
培养液
(Hyclone
公司
)
；双抗
(
青、链霉素，
100 UI/ml)
；
Triton X-100(Genview< br>分装
)
；二甲基亚砜、肌苷酸钠
(Sigma
分装
)
；低熔
点琼脂糖
(FMC
分装
)
；常熔点琼脂糖
(Span ish
分装
)
。其余生化试剂均为分
析纯。电泳仪：由西北大学物理系提供； 电泳槽：
DYC33A
型
(
北京市六一仪
器厂
)
； 显微镜：
Leica DM LB 2 (Leica
公司
)
；彗星图象分 析软件：
CASP
软件
(casp-1.2.2


1.4
实验分组及
UV
处理



收集 对数生长的
K562
细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于
95
％，用
Hank's(pH7.4)
调整细胞密度至
1×105/ml，
接种于塑料培养皿 中(ф=35
mm，
2 ml/plate)
，然后进行紫外线照射
(0.3 mW/cm2)
。实验分为对照 组和
8
个
照射组，各照射组分别照射
3
、
5
、10
、
40
，
60
、
120
、
180
、
240 s
，对照组
不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。



1.5
细胞活性检测

台盼蓝拒染法
[10 ]
即时检测经
UV
处理后
K562
细
胞的活性。



1.6
彗星实验

1988
年
Si ngh
等
[5]
建立了碱性彗星实验，
我们对该实
验流程进行改良， 首先改变了制胶方法，并在裂解后加入水洗的操作步骤，
中和完成后再用梯度酒精脱水。具体流程如下： ①镀膜法制备底胶，将洁净
的载玻片在
0.2
％的常熔点琼脂糖中浸没
1 min
后，置
37 ℃孵箱烘烤过夜；
实验时将细胞悬液与低熔点琼脂糖(42 ℃) 以
1∶1
的比例在离心管中混匀，
立即灌胶
(
先用盖玻片在已包被的 载片上搭一个
22 mm×10 mm×0.17 mm
的
小槽再灌胶
)
，
4
℃静置
15
min
后取下盖片，
制得含细胞胶层。
②裂解，
4
℃，
1 h
。③水洗，三蒸水
4 ℃水洗
3
次，
5 min/
次。④解旋，4 ℃，
20 min
。
⑤电泳，4 ℃，
20 min
，
0.8 V/cm
。⑥中和，
3
次，每次
5 min
。⑦梯度酒
精 脱水，
(50
％、
70
％、
80
％、
90
％、
100
％、
100
％，常温下各一次，每次
5
min)
。⑧染色
(EB
，20
μg/ml，20
μl),之后镜检，每组随机取
50
个细胞，
用
CASP
分析软件进行分析
[11
～
14]
。



1.7
统计学方法

实验数据进行
t
检验。



2
结

果



2.1
改良实验方法的结果

通过对制胶方法的改进，基本解决了实验中常见的脱胶现象。
同时经梯度酒精脱水后的彗星图象基本位于一个焦平面
上
(< br>图
1)
，采图更为方便、可靠。



2.2
台盼蓝染色

结果显示紫外线照射没有产生致死性损伤。



2.3
彗星实验结果



由表
1< br>可知，
UV
照射
K562
细胞从最短的照射时间
(3 s
，
0.9 mJ/cm2)
开始，实验组尾长、彗星长、尾矩、
Olive
尾矩均大于对照组，且差异具有
统计学意义
(P<0.01)
。当
UV
照射时间延长到
240 s
时，各参数不再增加。
从
3 s
到
180 s
，这些检测参数均表现出时间依赖效应。



表
2的数据显示，
实验组彗星头部半径、
头部的面积、
头部的
DNA
含量、
头部平均荧光强度、头部
DNA
百分比随照射时间的增加，表现出振荡模式。< br>


表
3
的实验结果显示，
UV
处理后，
实验组细胞核
DNA
尾部的面积、
尾部
DNA
、尾部
DNA
百分比均大于对照组，
t
检验有统计学意义
(P<0.01)
，且随
UV
照射时间的延长，
除尾部平均荧光强度外，
其它各参数下实验组 表现出增
加的趋势，显示出时间依赖效应。



3
讨

论



DNA
分子中的共轭键可吸 收较短波长的紫外线，从而导致自身发生损伤
[15]
。彗星实验可以检测
DNA链断裂损伤。



我们采用改良的彗星实验进行检测，用尾长、彗星长 、尾矩，
Olive
尾
矩作为分析指标，
结果显示，
0.3mW/c m2
UV
照射
3
s
即可造成细胞
DNA
损伤，
且随
UV
照射时间的增加，
DNA
损伤也增加，
表现出良好 的时间效应关系，
说
明改良的彗星实验方法和上述四种分析指标比较可靠。当照射时间增加到< br>240 s
时，各分析指标有下降的趋势，表明彗星实验有检测的阈值，当细胞
损伤程度 超过此值后，该方法就不能够进行准确的检测。



当以尾部的面积、尾部 的
DNA
和尾部的
DNA
百分比作为分析指标时，结
果表现出时间依 赖性，
提示可以将这些参数用作
DNA
损伤的分析指标。
Durand
等
[16]
分析了彗星图象的几种指标
(
尾长，
彗星尾部
DNA
百分比，
彗星尾矩
)
，
发现尾矩这一指标具有分析范围广的特 点。
我们的实验结果与他们的研究有
较好的一致性。



由于尾矩、
Olive
尾矩等分析参数可以反映尾部的面积、尾部的
DNA
含
量以及尾部的
DNA
百分比，因此选择尾长、彗星长、尾矩、
Olive尾矩作为
彗星实验的分析指标，均能较好反映细胞
DNA
的损伤程度。而采用彗星 头部
半径、头部面积、头部
DNA
含量、头部
DNA
百分比和头、尾 部的平均荧光强
度作为分析指标时，损伤程度随
UV
光强的增加表现出振荡模式，提示 这
6
种分析指标不适合用作彗星实验
DNA
损伤的评价指标。综上，我们建立 的改
良彗星实验系统具有较好的可靠性，
CASP
分析软件可用于彗星实验的分析，< br>彗星长、尾长、尾矩和
Olive
尾矩，均能较好地反映细胞
DNA
的 损伤程度。

由
Osting
和
Johanson
于
1984
年首先提出的微电泳技术
,1988
年经
Singn
等进一步完善
为单细胞凝胶电泳
( single cell gel elect rophoresis , SCGE)
。
SCGE
是一种在单细胞水平
上检测
DNA
链损伤的方法
,
其原理 是
:
包埋在琼脂糖凝胶中的细胞在中性或碱性条件下经
裂解与解旋后
,
带负电荷的
DNA
游离断片
,
在电场作用下向阳极迁移。
在荧光 显微下观察
,
受损
DNA
形成的影像形似夜空中的彗星
,
故又称“彗星试验”
(Comet Assay)
。彗星试验
检测单细胞

水平
DNA
损伤
,
无需放射性示踪
,
适用于各种有核细胞
,
样品用量少,
试验周期短
,
故而灵
敏、快速、简便
(1
,2)
。目前国内外对彗星试验研究的热点主要集中在两个方面
:
彗星试
验的应用与 方法学研究。

1

彗星试验的应用

111

检测化学物质引起的
DNA
损伤目前
,
对化学物质的
DNA
损伤作用检测依然是彗
星 试验的主要应用范围。自彗星试验建立以来
,
已有多种物质的
DNA
损伤作 用经过检测
,
对金属化合物、氧化剂、烷化剂、交联剂的研究都有报道。近年来的研究不仅仅局 限在
物质是否造成
DNA
损伤
,
在损伤机制、
损伤与修复问题上已有了新的探索。
li 等
用彗星试验检测了五种氯化烷、
烯类物质
,
结果证明
:
氯基数目的多少与双键是否存在使物
质致
DNA
损伤作用存在质和量的差别
,
含氯数目越多
,DNA
损伤作用越强
,
带双键的烯类
比无双键的烷类

损伤作用强
,
说明物质的
DNA
损伤作用与其结构密切相关
(3)
。
Toshio Kasamatsu
将彗星
试验改良
,
使细胞裂解后再染毒
,
并与传统彗星试验 比较
,
结果发现
:
所检测的直接致突变物
,
在改良法和传统 法中均得到阳性结果
;
需要经过代谢或膜作用才能对
DNA
造成损伤的间< br>接致突变物则只在传统法中得到阳性结果
,
在改良法中为阴性
,
这一研 究成果对我们分析
遗传毒物的化学与生物特性颇有参考价值
(4)
。

112

化学物质的靶组织遗传毒性评价
B.
L.
Pool2Zobel
等将从人体组织直肠获得的细