肝素钠价格分子实验报告酶切

2021年2月2日发(作者：鸡鸡毛)
质粒
DNA
酶切、连接、转化、筛选、鉴定

实验原理
< br>重组质粒的构建需要对
DNA
分子进行切割，
并连接到合适的载体上进行体外重 组。
限
制性核酸内切酶和
DNA
连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供 了有力的工具。

限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒 等
DNA
分子小的只有几千碱基，
大的也不超过几十万碱基，
编码的基因较少 ，
获得目的基因的方法
也比较简单。

DNA
连接酶催化两双链DNA
片段相邻的
5’
-
磷酸和
3’
-
羟基间 形成磷酸二酯键。
在分子克
隆中最有用的
DNA
连接酶是来自Ｔ４噬菌体的< br>DNA
连接酶：
T4 DNA
连接酶。
T4 DNA
连接< br>酶在分子克隆中主要用于：
1
、
连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2
、
连接双链
DNA
分子间的平端；
3
、在双链平端的
DNA
分子上添加合成的人工接头或适配子。

目的
DNA
片段与载体
DNA
片段之间的连接方式（以
T
4
DNA
连接 酶为例）主要有以下几
种：

（一）、具互补粘性末端片段之间的连接
大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割
DNA
分子，
形成
1~ 4
核苷酸单链的粘
性末端。当载体和外源
DNA
用同一种限制性内切酶切割时 ，产生相同的粘性末端，连接后
仍保留原限制性内切酶的识别序列；
如果用两种能够产生相同的 粘性末端的限制酶
（同尾酶）
切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组
DN A
分子消失了原来用于切割的那两
种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整 地将插入片段重新切割下来。

（二）、平末端的连接

载体分子和外源DNA
插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情
况都是例外的，因为 有些限制酶切割
DNA
分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验
要用两种不同的 限制酶分别切割载体分子和外源
DNA
，形成的也多半是非互补的粘性末端
或平末端；
再如用机械切割法制备的
DNA
片段，
PCR
扩增的和化学合成的< br>DNA
片段或由
RNA
为模板反转录合成的
cDNA
片段，也 不会具有互补的粘性末端。

理论上任何一对
DNA
平末端均能在
T
4
DNA
连接酶催化下进行连接，这给不同
DNA
分子
的连 接带来了方便。但是，平末端连接更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平末端的
5’
磷酸基团 或
3’
羟基与另一个平末端的
3’
羟基和
5’
磷酸基团同时 相遇的机会显著减少，通常平
末端的连接速度为粘性末端的
1/10~1/100
。为 了提高其反应活性，一般选择
16
℃较为合适。

外源目的基因与载体在体外 连接重组后形成重组
DNA
分子，重组
DNA
分子必须导入适
宜的受 体细胞中方能使外源目的基因得以大量扩增或表达。
随着基因工程的发展，
从低等的
原 核细胞，
到真核细胞，
进一步到结构复杂的高等动、
植物细胞都可以作为基因工程的受 体
细胞。选择适宜的受体细胞已成为重组基因高效克隆或表达的基本前提之一。

所谓受体细胞（
receptor cell
）又称为宿主细胞或寄主细胞（
host
cell
）等，从实验技 术
上讲是能摄取外源
DNA
并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理 论研究
价值的细胞。
显然，
并不是所有的细胞都可用作受体细胞。
一般情况下 ，
受体细胞的选择应
符合以下基本原则：

（
1
）便于重组
DNA
分子的导入；（
2
）能使重组
DNA
分子稳定存在于 细胞中；（
3
）便
于重组体的筛选；
（
4
）遗传稳定性高， 易于扩大培养或发酵生长；（
5
）安全性高，无致病
性，不会对外界环境造成生物污染 ；（
6
）选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的
细胞，利于外源基因蛋白表达 产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达；（
7
）
受体细胞在遗传密码的应 用上无明显偏倚性；（
8
）具有较好的转译后加工机制，便于真核
目的基因的高效表达 ；（
9
）在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。以上是受体细胞
选择的总原则， 在实际应用过程中，可根据具体需要或用途而重点考虑其中部分要求即可。

原核生物细胞
:
是较为理想的受体细胞类型，其原因是：


1
（
1
）大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA
进入；（
2
）没
有核膜，染色体
DNA
没有固定 结合的蛋白质，为外源
DNA
与裸露的染色体
DNA
重组减少了
麻烦 ；
（
3
）基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析 ；
（
4
）
原核生物多数为单细胞生物，
容易获得一致性的实验材料，
并且培养简单，
繁殖迅速，
实验周期短，重复实验快。

鉴于上述原 因，原核生物细胞普遍作为受体细胞用来构建基因组文库和
cDNA
文库，或
者用来建 立生产目的基因产物的工程菌，
或者作为克隆载体的宿主菌。
至今被用作受体菌的
原核 生物有大肠杆菌、
枯草杆菌等。
大肠杆菌是迄今为止研究得最为详尽、
应用最为广泛的
原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。

体外连接的
DNA
重组分子导入合适的受体细胞才能大量地进行复制、增殖和表达，将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化（或转染）、转导、显微注射和电穿孔等多种
不同的方 式。本实验以大肠杆菌为受体的基因转移。

转化方法：重组质粒
DNA
分子 通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维
持和表达的过程称之为转化
（
transformation
）
。
细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供
体菌的游离
DNA
片段，即转化因子，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，< br>从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。

以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可能机制包括如下基本步骤：

（
1
）细菌感受态的形成；（
2
）转化因子的吸收；（
3
）整合复合物前 体的形成；（
4
）
单链
DNA
转化因子的整合；（
5
）转化子的形成。

大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，其细胞表面的结构和组成均与革兰氏阳性 细菌有所不
同，
自然条件下很难进行转化，
其主要原因是转化因子的吸收较为困难，< br>尤其是那些与其亲
缘关系较远的
DNA
分子更是如此。因此在大肠杆菌的重组质 粒
DNA
分子的转化实验中，很
少采取自然转化的方法，
通常的做法是采用人 工的方法制备感受态细胞，
然后进行转化处理，
2
其中代表方法之一是
Ca< br>诱导的大肠杆菌转化法。

Ca
2
诱导的转化：细菌处于容易吸收外源
DNA
状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入
感受态的操作叫致敏过程。重组
DNA
转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱
导细菌细胞进入一个敏感的感受态 ，以便外源
DNA
进入细菌内。其原理是将处于对数生长
2
期的细菌置于0
℃，
CaCL
2
低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，同时
Ca< br>
使细胞膜磷脂层形成
液晶结构，
使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开 所在区域，
这就构成了大肠杆菌人
工诱导的感受态。此时加入
DNA
，
Ca
2

又与
DNA
结合形成抗脱氧核糖核酸酶（
Dna se
）的羟
基
-
磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的< br>42
℃热脉冲处理后，细菌细
胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通 透性增加，
DNA
分子便趁机进
入细胞内。

Ca
2
处理的感受态细胞，一般每微克
DNA
能获得
10
5
～
1 0
6
个转化子，环化重组子
分子愈小，转化率愈高，环状
DNA
分子 比线性
DNA
分子的转化率高
1000
倍。

转化子的筛选 以及鉴定：在重组
DNA
分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受
体细胞都能被 导入重组
DNA
分子，一般仅有少数重组
DNA
分子能进入受体细胞，同时也 只
有极少数的受体细胞在吸纳重组
DNA
分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量 未被转
化的受体菌细胞混杂在一起。
再者，
在这些被转化的受体细胞中，
除部 分含有我们所期待的
重组
DNA
分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与 多个外源
DNA
片段形成非
期待重组
DNA
分子导入所致。
因此，
如何将被

转化细胞从大量受体菌细胞中初步筛选出来，
然后进一步检测到含有期待重组

DNA
分子的克隆子将直接关系到基因克隆和表达的效果，
也是基因克隆和工程操作中极为重 要的环节。

通常我们将导入外源
DNA
分子后能稳定存在的受体细胞称为转 化子，而含有重组
DNA
分子的转化子被称为重组子，
如果重组子中含有外源目的基因 则又称为阳性克隆子或期望重
组子。


2