冰片霜实验一、血液标本提取DNA(蛋白酶K-酚抽提法)

2021年2月2日发(作者：胆囊腹腔镜手术费用)
实验一、血液标本提取
DNA
（蛋白酶
K-
酚抽提法）


一、实验原理

离心分离到外周血的白细胞层；用细胞裂解液溶解细胞膜、 核膜，使组蛋白与
DNA
分离，再用酚、三氯甲烷
/
异戊醇抽提去除蛋白质， 最后经乙醇沉淀即可得
到基因组
DNA
片段。

二、实验步骤：

1
、
血液标本处理


1.0ml
抗凝全血
(ACD
、
EDTA
抗凝均可

)2000rpm
离心
10min
（
1.5mlEP
管）。

轻轻去上清液（血浆），吸出淡黄色悬浮液（白细胞
层）置于另一
2.0m lEP
管中。（约
50
μ
l
）

2
、细胞裂解

加入
10
倍体积组织细胞裂解液，< br>37
℃
1h
，

3
、
加入蛋白酶
K
消化


加入蛋白酶< br>K
至终浓度
100
μ
g/ml
（约
4
μl
）
，
充分混匀，
37
℃震荡
12-24h
或
37
℃
1h
后，
56
℃水浴
3h
。保温过 程中不时摇动，混匀反应
液。液体逐渐变粘稠，表明已有
DNA
释放出来，操作应轻柔 。

4
、酚抽提：将上述溶液冷却至室温，加等体积的
Tris
饱和 酚（
pH8.0
）溶液，
温和缓慢颠倒离心管
10min
，混匀两相 成乳液。
12000rpm 5
分钟，两相分层。用
宽口径移液管小心吸出上层粘稠的 水相，
移至一新的
2.0mlEP
管中。
（小心一点，
不要吸入蛋白 层。
如交界处有白色沉淀，
需重新抽提有机相，
用酚重新抽提两次，
合并水相 ）

5
、三氯甲烷
/
异戊醇抽提


< br>上清液加等体积三氯甲烷：异戊醇（
24
：
1
）
，倒转
混匀
10
分钟，
12000rpm5
分钟，取上层水相
0.5ml
入另一新的
2.0mlEP
管；

6
、
DNA
沉淀


上清液中加
0.2
倍体积
3.0mol/L
醋酸钠，
再加
2
倍体积的
4
℃冰
箱冷却后的无水乙醇，轻柔振摇，充分混匀；应可 看到白色絮状物（
DNA
）
。
12000rpm 5
分钟，弃上清液；

7
、纯化：加
1ml 70%
乙醇洗涤，
12000rpm
离心
5
分钟，去上清夜，重复
1
次；
（此过程不得振荡摇动）

8
、溶解：弃上清液后，自然干燥（挥发痕量乙醇）后，用
30
μl

pH8.0TE
完全
溶解，保存在
-20
℃备用。

三、注意事项

1
、加样准确，操作轻柔；微量加样器绝对不能超过最大量程；

2
、加酚试剂时，不要接触到皮肤上，有腐蚀性；如不小心弄到，立即用清水冲
洗；

3
、取上清液时，不可吸到下层溶液；

4
、加
TE
液后轻摇
10min
溶解
DNA
或
-4
?
C保存待用。

5
、一次性用品、废液集中处理。注意试剂配置中的浓度为终浓度。

四、小结

1
、总结实验情况，指出存在的问题

实验二




DNA
浓度、纯度及完整性的测定

一、实验原理

1
、
在
250~270nm
处核酸分子中的碱基有最大吸收
.260nm
下，吸光值等于
1
时相
当于
50
μ
g/ml
的dsDNA
，
40
μ
g/ml
的
ssDNA
或
RNA
，
33
μ
g/ml
的寡核苷酸。

2
、
主要通过
A260
与
A280
的比值来判定有无蛋白质 等的污染。
比值升高或降低
均提示制备的核酸纯度不佳。

DNA
纯品
:

OD260/OD280 = 1.8


RNA
纯品
:

OD260/OD280 = 2.0
（
1.8~2.1
）

经验：

纯
DNA
：
OD260/OD280
≈
1.8(
＞
1.9,< br>表明有
RNA
污染；＜
1.6
，表明有蛋白质、
酚等污染）< br>

纯
RNA
：
1.7
＜
OD260/O D280
＜
2.0
（＜
1.7
时表明有蛋白质或酚污染；＞
2.0
时
表明可能有异硫氰酸残存）

若样品不纯，
则比值发生变化 ，
此时无法用分光光度法对核酸进行定量，
可使用
其他方法进行估算。


3
、以
EB
为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性

基因组
DNA
如果发生降解，电泳图呈拖尾状

二、实验步骤

1
、
DNA
浓度与纯度的测定：取
10
μ
l DN A
样品与
2.0ml
双蒸水混匀，用
0.5CM
比色杯在紫外分光光 度计上测定
A260
和
A280
。进行计算。

2
、
DNA
完整度电泳：

（
1
）
1%
琼脂糖凝胶的制备：
称取
0.4g
琼脂糖于锥形瓶中，
加入< br>40ml 0.5xTE
液，
沸水浴完全溶解，冷却至
60
℃时加入< br>30
μ
l 1mg/ml
的
EB
液混匀，倒入插有梳齿
的凝胶制备模板上，厚度约
3mm
（超过梳齿
2mm
）
。完全凝固 后轻轻取出梳齿。

（
2
）点样：将凝固的凝胶轻轻推入装有
0.5 xTE
液的电泳槽中，液面浸没胶面即
可。
点样孔朝负极，
加
5V< br>电压。
取
2
μ
l
溴酚蓝加样液于塑料膜上，
加入< br>5
μ
lDNA
样品。混匀，加入凝胶点样孔中，记录好位置。

（
3
）电泳：以
8-10V/CM
凝胶电泳
40min~60mi n
。
（根据溴酚蓝指示剂的位置判
断）

（
4
）结果观察：用塑料片轻轻取出凝胶放在紫外透射仪中观察。

三、实验结果与计算

1
、
DNA
浓度与纯度

DNA
浓度（
μ
g/ml
）

= A260x50x
稀释倍数

DNA
纯度
=A260/A280
2
、
DNA
电泳作图

四、注意事项

1
、各种试剂加量应准确。

2
、制胶时需要一次完成，不得断续倒 胶和产生气泡。取出梳齿时不要弄破凝胶
孔。

3
、先加
5V
电压可以防止先加样的
DNA
扩散，加样时不要弄破凝胶孔。

4
、注意紫外透射仪的紫外线防护。

5
、紫外线照射时间过长会引起
DNA
荧光强度下降。

五、小结

实验三
RNA
抽提与测定
(TRIZOL
法
)
一、实验原理

以异硫氰酸胍
-酚的单相裂解液裂解细胞，再加入氯仿后形成两相，变性的
DNA
与蛋白质介于两相的交界 面，可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来。保留于
上层水相的
RNA
，通过异丙醇沉淀与
75%
乙醇洗涤而制备。

二、操作步骤

1
、样 品处理：在洁净玻璃试管中加
6ml
红细胞裂解液，取抗凝全血
2.0ml
， 混
匀，
室温放置
10min
。
以
4000rpm
离 心
8
分钟，
去上清，
收集底部的细胞。
加
1.0ml
红细胞裂解液，混匀，移入
1.5mlEP
管（经处理的）中，
3000rpm离心
5min
，去
上清，即得所需细胞。用移液管加
TRIZOL
试剂
反复吹打来裂解细胞至均一通亮
的液态后，室温放置
5
分钟以使核蛋白体完全分解。

2
．分离阶段（提取）

每
1 mlTRIZOL
加
0.2 ml
三氯甲烷。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管
15
秒
并将其在室温下孵育
2
—
3
分钟。在
4
°C
12000rpm
高速冷冻离心
15 < br>分钟。
(
离
心后混合物分成三层：下层红色的苯酚
-
三氯甲烷 层，中间层白色，上层无色的
水相层。
RNA
存在于水相层当中。
水相层的容量大约为所加
TRIZOL
容量的
60%
。
)
3
．
RNA
的沉淀

将上层水相层转移到另一
1. 5mlEP
管中，
通过将水样层和异丙醇混合来沉淀
RNA
。
最初均 化时的每
1 mlTRIZOL
对应
0.5 ml
异丙醇。将混合的样品在室温放置
10
分钟并
4
°C
12000rpm
高速冷冻离心
10
分钟。
RNA
沉淀在 离心前通常不可见，
形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。

4
．
RNA
的洗脱

弃去上清液。用
75%
的乙醇洗涤
RNA
沉淀一次，每
1 ml
的
TRIZOL
加
1 ml
的
75%
乙醇。
4
°C 下以不超过
7500rpm
的冷冻离心
5
分钟。

5
．
RNA
的再溶解

弃去上清液，室温下挥发掉痕量的乙醇，用
30
μ
l
DEPC双蒸水溶解
RNA
，并在
55
—60°C
下孵育
10
分钟。

6
、
RNA
浓度与纯度的测定：取
10
μ
l RN A
样品与
2.0ml
双蒸水混匀，用
1.0CM
比色杯在紫外分光光 度计上测定
A260
和
A280
。进行计算。