泉州清蒙医院分子实验中核算DNA提取常见问题及分析

2021年2月2日发(作者：胆囊息肉原因)



分子实验中核算
DNA
提取常见问题及分析
一、基因组
DNA
提取常见问题分析

1
．样品材料老化或反复冻融导致
DNA
含量下降：


应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或细嫩
的植物组织等，不能即时处理的样品应立即放入液氮或
-70C
低温保存，
以免
DNA< br>降解。

2
．样品破壁或裂解不完全，
DNA
未充分释放：



动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，
G +
细菌、酵母等破壁较困难的 样
品应用溶菌酶、
Lyticase
酶或机械方式协助破壁。

3
．样品量过多导致细胞裂解不充分：


加样量过 多使裂解液和样品混合不均匀，细胞裂解不充分。不同来源样品
的加样量不同。

4
．
DNA
吸附不充分：



如在上吸附柱前未加无水乙醇，
或用低浓度乙醇代替无水乙醇，
则导致
DNA
不能充分沉淀，
与硅胶膜吸附不彻底，
因此应在样品裂解后加适量无水乙醇，
再
上吸附柱使
DNA
与硅胶膜充分吸附。





5
．
DNA
洗脱不适当：


洗脱 缓冲液
pH
值过低会阻碍
DNA
从硅胶膜上洗脱下来，
应确保洗脱液
pH
值在
7.0-8.5
之间。


洗脱体积过少，
若小于
30ul,
不易完全浸透硅胶膜，
使
DNA
不能全部洗脱下
来，因此洗脱缓冲液应大于
30ul
。同时如洗脱体积过大， 超过
200ul,
则所得的
DNA
浓度会降低，但
DNA
总 量不会减少。


洗脱时可将洗脱缓冲液在
65-70
℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置
2-5
分钟，可提高洗脱效率
,
加大
DNA
产量。

二、提取的基因组
DNA
有降解，如何解决
?

1
．选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存：


陈旧血液，老化菌液等不新鲜的材料中，细胞凋亡导致
DNA
降解，或低温
保 存的样品反复冻融导致细胞破裂，内源核酸酶降解
DNA
，因此应选择新鲜的
材料样品 ，不能及时处理则低温保存，运输过程中亦应使用干冰。

2
．未能有效抑制内源核酸酶作用：


某些
DNase
含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨
过程中应随时补充液 氮，
并在样品未完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌
合剂的裂解液。

3
．操作过于剧烈导致
DNA
被机械打断：


预处理的样品加入细胞裂解液后，所有操作应尽量柔和，避免振荡、搅拌
等剧烈机械力对
DNA
片段的损伤。

三、未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？

1
．大肠杆菌老化






请涂布平板培养后，重新桃选新菌落进行液体培养。

2
．质粒拷贝数低


由于使用低拷贝数载体引起的 质粒
DNA
提取量低，
可更换具有相同功能的
高拷贝数载体。

3
．菌体中无质粒


有些质粒本身不能在某些菌种 中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒
丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不 要频繁转接，每次
接种时应接种单菌落。另外，粒查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

4
．碱裂解不充分


使用过多菌体培养液，会导致 菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶
液
P1
、
P2
和
P3
的用量，对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用
溶液
P1
、
P2
和
P3
，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。

5
．溶液使用不当


溶液
P2
、
P3
在温度较低时可能出现浑浊，
应置于
37C
保温片刻直至溶解为
清亮的溶液，才能使用。

6
．吸附柱过载


不同产品中吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。
若用富集培养基，例如
TB
或
2*YT
，菌液体积必须减少；若质粒是非常的拷贝
数或宿主 菌具有很高的生长率，则需减少
LB
培养液体积。

7
．质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）


洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

8
．乙醇残留







漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。

9
．洗脱液加入位置不正确



洗脱液应中 在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到
最大洗脱效率。

10
．洗脱液不合适


DNA
只在低盐溶 液中才能被洗脱，
如洗脱缓冲液
EB
（
10Mm Tris-HCI,1Mm
EDTA ,PH8.5
）或水。洗脱效率还取决于
PH
值，最大洗脱效率在
pH 7. 0-8.5
间。
当用水洗脱时确保其
pH
值在此范围内，如果
pH< br>过低可能导致洗脱量低。洗脱
时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至
60
℃后使用 ，有利于提高洗脱效率。

11
．洗脱体积太小


洗脱体积对回收率有一定影响，随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品
浓度降低。为了得到较 高的回收率可以增大洗脱体积。

12
．洗脱时间过短


洗脱时间对回收率也会有一定影响。
洗脱时放置
1
分钟可达到较好的效果。< br>
四、用自动荧光测序没有结果，如何解决？


测序 反应体系中
DNA
的量加得不够，
提取的质粒要经过琼脂糖凝胶电泳定
量。要 使用新鲜的
LB
培养基和新活化的菌株摇菌。

五、质粒纯度不高，如何解决？

1
．混有蛋白


不要使用过多菌体，经溶液
P1
、
P2
、
P3
处理 ，离心后溶液应为澄清的，如
果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心去除后再进行下一步骤。