氨苄西林钠舒巴坦钠实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告

2021年2月2日发(作者：胡萝卜素血症)

实验一、质粒
DNA
的提取及检测

【实验目的】

1
、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤

2
、掌握琼脂糖凝胶电泳检测
DNA
的方法和技术

3
、学会
PCR
操作的基本技术

第一部分


质粒
DNA
的提取

一、实验原理：

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒
DNA
与线性染色体
DNA
在拓扑 学上的差
异来分离它们。在
pH
值介于
12.0
～
12.5
这个狭窄的范围内，线性的
DNA
双螺旋结构解开
而被变性，尽管在这样的条 件下，共价闭环质粒
DNA
的氢键会被断裂，但两条互补链彼此
相互盘绕，仍会紧密地 结合在一起。当加入
pH4.8
的乙酸钾高盐缓冲液恢复
pH
至中性时，共价闭合环状的质粒
DNA
的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染
色体
DNA
的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成 网状
结构，通过离心，染色体
DNA
与不稳定的大分子
RNA
，蛋白 质
-SDS
复合物等一起沉淀下
来而被除去。

二、仪器与试剂

1
、仪器



恒温摇床、台式离心机

2
、试剂



溶液
I
、
溶液Ⅱ
、
溶液Ⅲ、无水乙醇、
TE
缓冲液 、胰
RNA
酶、酚、氯仿

三、实验步骤

1
、

将
2mL
含相应抗生素
（
Amp: 50
μ
g/mL
）
的
LB
液体培养基加入到试管中，
接入含
pUC19
质粒的大肠杆菌，
37
℃振荡培养过夜。

2
、

取
1.5mL
培养物倒入微量离心管中，
4 000r/min
离心
2min
。

3
、

吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4
、

将细菌沉淀 悬浮于
100
μ
L
溶液
I
中，充分混匀，室温放置
10 min
。

5
、

加
200
μL
溶液Ⅱ（新鲜配制）
，盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上
5min
。

6
、

加入
150
μ
L
溶 液Ⅲ（冰上预冷）
，盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置
15min
。

7
、

12000r/min
，离心
15min
， 将上清转至另一离心管中。

8
、

向上清中加入等体积酚：氯仿（
1
：
1
）
（去蛋白）
，反复混匀，
12000r/ min
，离心
5min
，
将上清转移到另一离心管中。

9
、

向上清加入
2
倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置< br>5
～
10min
。
12000r/min
，离心
5m in
。
倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

10
、 用
1mL70
℅乙醇洗涤质粒
DNA
沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽 干或空气中干
燥。

11
、加
20
μ
LTE
缓冲液，其中含有
20
μ
g/mL
的胰
RNA
酶，使DNA
完全溶解，
-20
℃保存。