吃什么早餐可以减肥-李亚萍
一:
基因组
DNA
的提取
采用
SDS
法,具体步骤如下:
①
称取
2-4
克(油菜)叶片,放入研钵中,加液氮后充分研磨。
②
转入
20ml (
约样品的一倍体积
) DNA
提取液中,
混匀,
65
℃
水浴振荡
(
301-501 rpm
)
1h
左右。
③
取出冷却至室温,加入 等体积氯仿
/
异戊醇(
24:1
)混合液,充分混匀
后,置摇
床上轻摇一小时。
④
室温振荡
1h
左右使之完全混合。
⑤
室温
3000rpm
离心
30min
。
⑥
取上清液加入
2
倍体积预冷的无水乙醇,
-20
℃
静置
1h
后,使
DNA
沉淀。
⑦
钩出
DNA
,于
70%
酒精中漂洗
2-3
次。
⑧
挑出
DNA
,用
DNA
真空干燥机真 空干燥后,溶于适量
TE
(
pH=8.0
)中。
DNA
纯化:加入适量
10mg/ml RNase
,置
37
o
C 30min
,充分降解
RNA
。
再用氯仿
-
异戊 醇抽提一次,
DNA
沉淀、干燥、溶解程序同上。取适量
DNA
稀释液与标准 浓
度
λDNA
同时在
1%
琼脂糖凝胶电泳上进行
DNA定量并检查
DNA
质量。
附:
(
1
)
DNA
提取液(
1000ml
)
100ml
100ml
62ml
637.5 ml
1M Tris- HCl
(
PH8.0
)
5M NaCl
20% SDS
ddH
2
O
即配即用,充分混匀后调节
pH
至
8.0
。
(< br>2
)
50×
TE
(
100ml
)
Tris-HCl
冰醋酸
242g
18.6g
57.1ml
0.5M
EDTANa
2
(
PH8.0
)
100ml
Na
Bisufite
(Coda
S-9000)
3.8g
EDTA Na
2
加水至
1000ml
,灭菌。
(
3
)
Tris-HCl
pH=8.0
1M
1000ml
Tris
碱
H
2
O
浓
HCl
14.1g
800ml
49ml
混匀充分溶解后,调整
pH
至
8.0
,灭菌。
PCR
反应在
10
?
l
体系中进行
模板(基因组
DNA
)
Primer (R)
Primer (F)
10×
buffer
dNTP (2.5mM)
MgCl
2
(25mM)
Taq
酶
1
?
l
(
10ng/
?
l
)
0.2
?
l
(
10uM
)
0.2
?
l
(
10uM
)
1
?
l
0.8
?
l
0.8
?
l
0.1
?
l (0.5U)
ddH
2
O
H
2
O
5.9
?
l
10
?
l
PCR
扩增产物中加入琼脂糖凝胶电泳专用的 加样缓冲液
2
?
l
,
混匀,
取
4
?
l PCR
扩增产物用
1
%
琼脂糖凝胶电泳检测结果。电泳时总电压为120V
,电泳
1h
左右,
UV
检测扩增产物的多态
性 。
PCR
扩增条件
94
℃
3min
30Sec
50Sec
35 cycles
1min
10min
保存
94
℃
X
(按所用引物确定退火温度)
72
℃
72
℃
4
℃
二
:
种子贮藏蛋白质样品的提取
按
Hurkman
和
Tanaka
(
1986
)的苯酚为基准的总蛋白 样品提取方法,并有所改进。将
0.5 g
成熟种子在液氮中研磨成粉末状,分别加入提取液
10mL [50%
(
v/v
)苯酚
, 0.45 M
蔗
糖
, 5 mM EDTANa
2
, 0.2%
(
v/v
)
β
-
巯基乙醇
, 50 mM Tris-HCl
,
pH 8.8]
,充分混匀后将装有
匀浆液的离心管在< br>4
℃条件下,摇床上振荡
30 min
,然后
4
℃
5000 g
离心
15 min
,吸取上清
液至新一离心管中加入< br>5
倍体积的
-20
℃的
0.1 M
乙酸铵(
0.7708 g
乙酸铵溶解在无水的
100
mL
甲醇中)
,
-20
℃冰箱静置沉淀
16 h
或过夜。第二天
4
℃
5000 g
离心
10 min
,沉淀的蛋白
用
0.1 M
乙酸铵洗涤
2
次,再用冰 冻的
80%
的丙酮洗
1
次,最后用
70%
的乙醇洗涤后,蛋 白
粉
37
℃干燥后,放置
-70
℃冰箱保存备用。
(接下来 要做
SDS-PAGE
跑垂直胶)
SDS-PAGE
电泳
按
Sambrook
等
(
1989
)
的
SDS-PAGE
程序,
取适量种子总蛋白样品与
2×
样 品缓冲液
(
100
mmol/L Tris-HCl
,
pH 6.8
,
200 mmol/L DTT
,
4% SDS
,
20% Glycerol
,
0.2% bromophenol blue
R)
混合,
99
℃变性处理
10 min
后,< br>在
8%
的分离胶和
5%
的浓缩胶组成的聚丙烯酰胺凝胶上电
泳 分离。使用
DYY 212
型电泳仪和
DYCZ 228C
型垂直双板夹芯式 电泳槽,电极缓冲液为十
二烷基硫酸钠
-
甘氨酸
(pH 8.3)
。
每个样品点样
15?
l
,
室温下
40V
电压待指 示剂到达分离胶与
浓缩胶界面时,再调至
100 V
稳压电泳,待指示剂迁移至凝胶底部后结束电泳。
染色和脱色
取下胶后,
在染色液
(
1.0 g
考马斯亮蓝
R250
,
450 mL
甲醇,
100 mL
冰醋酸,
450 mL
双
蒸水)中染色
30 min
,然后用脱色液(
100 mL
甲醇,
100 mL
冰醋酸,
800 mL
双蒸水)脱色
1 d
。
Rf
值及统计蛋白质亚基条带数
参照刘敏轩等(
2006
)的方法,根据电泳结果计算每个实验材料蛋白带的
Rf
值及统计
蛋白质亚基条带数。 蛋白质的相对迁移率
Rf
=
蛋白带迁移距离
/
溴酚蓝迁移距离。 记录样品
中产生的多态性蛋白带,同一
Rf
值位置上有蛋白条带的记为
1,无蛋白带记为
0
。输入计算
机,用
cluster
软件统计分 析,根据
Main
方法构建表征树。
三:
叶片全蛋白的 提取
——
三氯乙酸(
TCA
)
/
丙酮沉淀法
取油菜叶片
3-4g
放入预冷的研钵中加入液氮研磨成粉后(最好带上一次性手套,避免手
直接接触叶片)
,
加入
3
倍体积的蛋白提取液
[30mM Tris-HCl (pH8.0), 0.1mM EDTA
,
6 mM
抗
坏血酸,
5 mM MgCl
2
,
1% PVP
,
0.02% β
-
巯基乙醇,
1%
甘油,
2%SDS]
,动作迅速并始终
保持
4
℃下混匀;转移至
1.5m l
离心管中,
4
℃
15000rpm
低温离心
1 5min
;将上清液转入另
一离心管中,
向管中加
4
体积的
10%TCA
溶液
(10%
三氯乙酸中加入
0.02% β
-
巯基乙醇,
v/v)
,
混匀,
-20
℃静置
1~2h(或过夜,期间间歇一定时间振荡一次)
;
15000rpm
离心
15m in
,弃上
清液,沉淀用
80%
冷丙酮洗涤三次,最后用冷丙酮
-< br>乙醚液(体积
1:1
)洗涤,沉淀经真空干
燥得到粉末状蛋白,
-80
℃冰箱保存备用。
蛋白质的溶解
称取
1mg
蛋 白样品,在
1.5ml
离心管中加入
350?
l
水化缓冲液(含
7M Urea
、
2M Thiourea
、
4% CHAPS
、
65mM DTT
、
0.2% Bio-ampholyte, pH3~10
载体两性电解质、
0.001%
溴酚兰)
,
冰浴超声 波裂解后,在
4
℃、
8000rpm
离心
2min,
取上清液待测浓度。
采用
Bradford
法测定样品溶液中蛋白质含量
采用
Ramagli
改进的
Bradford
(
1976< br>)方法,考马斯亮兰
G-250
染料,在酸性溶液中与蛋白
质结合,使染料的最 大吸收峰的位置,由
465nm
变为
595nm
,溶液的颜色也由棕黑色变为 兰
色。经研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸
(
特别是精氨酸
)< br>和芳香族氨基酸残基
相结合。在
595nm
下测定的吸光度值
A
595
,与蛋白质浓度成正比。以蛋白质裂解液为空白
,
1mg/ml
BAS
标准蛋白
(
标准蛋白溶液用蛋白质裂解液配制
)
为标准制备标准曲线
,
在紫外可
见分光光度计上于
λ=595nm
测定用三氯乙酸
/
丙酮沉淀法所获得油菜蛋白质样品的含量。
溶液的配置
Bradford
储液
: 100mg
考马斯亮兰
G-250 , 50ml 95%
的乙醇,
100ml 85%
的正磷酸,用水
定容至
1000 ml
,
4
℃保存于棕色瓶中,可使用数周,使用前需要过滤。
标准蛋白溶液
: 1 mg/ml
的
BSA
溶液:
50mg BSA
,用水定容至
50ml
,
4
℃保存。
标准曲线的制作
取
0
,
20
,
40,
60
,
80
,
100?
l
不同体积的
BSA
标准蛋白质溶液(
1mg/ml
)于
6
支
10ml
小试管中,双蒸水调体积到
100?
l
,再加入过滤后的
5ml B radford
储液,充分振荡混合,
2min
后于
595nm
测定 光吸收值,测量应在
1
小时内完成。如表
5.1
所示。
表
5.1
BSA
标准曲线
Table 5.1
Standard curve of BSA
BSA
标准蛋白溶液
管号
Tube No.
(
?
l
)
BSA standard protein
Solution (?
l)
1
2
3
4
5
6
0
20
40
60
80
100
ddH
2
O
(
?
l
)
Double distilled
water (?
l)
100
80
60
40
20
0
Bradford
储液
(
ml
)
Bradford
solution(ml)
5
5
5
5
5
5
吸光值
(
A
595
)
Absorption
value(A
595
)
-
0.0335
0.0618
0.1503
0.2326
0.3275
以不 同浓度的
BSA
(
mg
)为横座标,测得的吸光值
A
595
为纵座标作标准曲线,作图得到一条
标准曲线,
根据标准曲线计算样品中蛋白质的含量。
四:
CTAB
法对油菜基因组
DNA
的提取
1)
取油菜植株的新鲜幼嫩叶片组织
100mg
,液氮冷冻研磨成粉末;
2)
将粉末转移至预冷的
2m1
Eppendorf
离 心管中,立即加入
65
℃预热的
2×
CTAB
提取液
700 ?
l
,涡旋振荡混匀,
65
℃温浴
30min
,期间轻轻颠 倒混匀
2-3
次;
3)
混合物冷却至室温后,于
4
℃,
12,000rpm
,离心
5min
;
4)
取上清液,加入等体积的氯仿
/
异戊醇(
24:1< br>)
,混匀,室温放置
10min
;
5)
4
℃,
12,000rpm
,离心
5min
;
6)
重复步骤(
4
)
(
5
)
;
7)
取上清液,加入三倍体积的冰冻无水乙醇,轻轻颠倒混匀至
DNA
沉淀;
8)
4
℃,
12,000rpm
,离心
2min
,弃上清,沉淀用
70%
乙醇洗涤两次超净工作台上吹干;
加入
100?
l ddH
2
O
(内含
20?
g/ml RNase
工作液)
,过夜溶解沉淀并消化
RNA
。
PCR
反应在
10
?
l
体系中
模板(基因组
DNA
)
Primer (R)
1
?
l
(
10ng/
?
l
)
0.2
?
l
(
10
?
M
)
吃什么早餐可以减肥-李亚萍
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