黄褐斑的症状实验七DNA体外重组技术

2021年2月2日发(作者：腰扭伤)
实验七


DNA
体外重组技术

一．概念

DNA
重组：指不同来源的
DNA
片段共价连接 ，通过重新组合，构成了具有两个
DNA
分子遗传信息的新的重组体
DNA
。

DNA
体外重组技术：是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法感兴趣的目的 基
因，在体外与载体
DNA
分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并筛选出表达重组
DNA
的活细胞，加以纯化、扩增、成为克隆，这一过程称为
DNA
体外重组 技术。
DNA
体外重
组技术是基因工程的核心内容。

二．基本过程

分、切、连、转、筛

1.
分：分离出要克隆的目的基因及载体。

①目的基因的来源：

ⅰ。直接分离

适于遗传背景了解比较清楚的细菌染色体、质粒及病毒
DNA
的提取分离。首先通过组建几
种限制性内切酶的物理图谱进行基因定位，然后用
DNA
的酶切片段电泳分离
DNA
，应用
相应
DNA
探针确定目的
DNA
后，从胶中回收
DNA
。

ⅱ。人工合成

序列明确的短
DNA
片段，可用
DNA
合成仪合成。

ⅲ。由
mRNA
逆转录合成
cDNA
细胞总
RNA
分离





mRNA
分离





目的基因
mRNA
的纯化





cDNA
第一链的合成







cDNA
第二链的合成





cDNA
发卡环的消化





cDNA
的克隆

ⅳ。从基因组文库中筛选目的基因

首先 构建基因组文库（
G
文库）或
cDNA
文库（
C
文库），需要时利用探针技术将所需目的
基因“钓”出来。

ⅴ。
PCR ②载体：可容忍外源性
DNA
片段插入，可在细胞间转移并能在细胞内自主复制的
DNA
分
子。

理想的质粒克隆载体应具有的特性：

ⅰ< br>.
能在宿主细胞中独立复制，并能携带
DNA
片段一同扩增

ⅱ
.
具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点
,
即多克隆位点
(M CS, multiple cloning sites)
，

便于进行克隆

ⅲ
.
分子量小，可插入较大的外源
DNA
而不影响复制

ⅳ
.
易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性、

α
-
互补显色反应（蓝白
斑筛选）

ⅴ
.
表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导序列，增强子等调控元件

ⅵ
.
生物安全性好

目前常用的载体有质粒、噬箘体、病毒等。

2.
切：用限制性内切酶切割目的基因和载体，使其产生便于连接的末端。

3.
连：将切割后的目的基因和载体用
T
4
DNA
连接酶连接。
4.
转：把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程（细菌：

，真菌 ：
Y
east
，昆虫细
胞或哺乳动物细胞）
。

5 .
筛：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需的特异性重组子。使用各种方法，将
带有 重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载体大小，酶切结果，筛选标记等。