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实验四
质粒
DNA
的提取与鉴定
一、实验目的
1
、熟悉细菌的培养和质粒的扩增。
2< br>、学习和掌握从大肠杆菌中提取质粒
DNA
的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒
DNA
的技术。
二、实验原理
质粒广泛存在与原 核细胞中，大多是双联的共价闭合环状
DNA
分子，长度可以从
1kb
到200kb
不等，是染色体外寄生性的自主复制子，在细胞分裂时能恒定地传递给子代细胞。
在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒
DNA
，通常使用松弛型（其复制受< br>宿主的控制不严格，在宿主细胞中拷贝数较多）质粒。
从大肠杆菌中分离质粒的方法很 多，
常见的有煮沸法和碱变性抽提法。
碱变性抽提法是
基于染色体
DNA与质粒
DNA
的变性与复兴差异而达到分离的目的。在
pH
高达
12.5
的条
件下，染色体
DNA
的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA
的大部分氢键也断裂，但
超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用< br>pH4.8
的醋酸钾高盐缓冲液调节
pH
至中性时，变形的质粒
DNA
又恢复到原来的构型，通过离心保留在溶液中，而染色体
DNA
不能复性，形成缠绕的 网状结构，与不稳定的大分子
RNA
、蛋白质等一起沉淀出来。
在抽屉过程 中，由于各种因素的影响，同一质粒
DNA
可能呈现以下不同的构型：①超
螺旋型，即 共价闭合环状
DNA
（
cccDNA
）
；②一条链发生一处或多处断 裂，致使另一条链
发生自由旋转，分子内的扭曲折叠消失，形成松弛的分子即开环
DNA
（
ocDNA
）
；③两条链
都发生了随机的断裂成为线状
DNA< br>。在这三种构型中，
cccDNA
由于扭曲折叠，体积很小，
在具有分子筛效应 的琼脂糖凝胶电泳中受到阻力最小，迁移速度最快；
ocDNA
因扭曲状态
被破坏而呈 松弛的环状，迁移速度较慢；线状
DNA
受到的阻力最大，迁移速度最慢。
DNA
分子在琼脂糖凝胶中泳动时，
除受分子构型的影响，
还受所带净电荷多少的影响 。
因此在鉴定质粒
DNA
纯度时，应尽量减少电荷效应。增大凝胶浓度可以在一定程度 上降低
电荷效应，
分子的迁移速度主要取决于受凝胶阻滞程度的差异，
由此将不同构型 的质粒
DNA
分开。
CccDNA
含量越高，表明制备的质粒
DNA
质量越好。电泳后用溴化乙锭染色，在紫
外照射下观察和照相记录电泳图谱。
三、材料、仪器和试剂
1
、
材料
大肠杆菌菌种
2
、
仪器
超净工作台 或无菌室，
恒温摇床，
低温高速离心机，
移液器，
恒温水浴锅，
涡旋 振荡器，
电泳仪，制冰机，凝胶成像系统等。
3
、
试剂
（
1
）
LB
液体培养基（
Luria-Bertani）
：称取蛋白胨（
Tryptone
）
10g
，酵母提取物（< br>Yeast
extract
）
5g
，
NaCl
1 0g
，溶于
800mL
去离子水中，用
NaOH
调
pH至
7.5
，用去离子水定容
至
1
升，高压灭菌
20mi n
。
（
2
）
LB
固体培养基：液体培养基中每升 加
12g
琼脂粉，高压灭菌。
（
3
）
溶液Ⅰ：
50 mmol/L
葡萄糖，
25mmol/LTris·
Cl
（
pH8.0
）
，
10mmol/L EDTA
（
pH8.0
）
。
溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100mL
，高压灭菌
15min
，储存于
4
℃冰箱。
（
4
）溶液Ⅱ：
0.2mol/LNaOH
（临用前用
10 mol/L NaOH
母液稀释）
，
1
％
SDS
。
（
5
）溶液Ⅲ：
5mol/L KAc60mL
，冰醋酸
1 1.5mL
，
H2O28.5mL
，定容至
100mL
，并高
压灭菌。溶液终浓度为：
[K+] 3mol/L
，
[Ac-] 5mol/L
。
（
6
）
饱和酚：
市售酚中含有 醌等氧化物，
这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致
RNA
和
DNA
的交联，应在
160
℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入
0.1
％的
8-
羟基喹啉
(
作为抗氧
化剂
)
，并用等体积的
0 .5mol/LTris·
Cl
（
pH8.0
）和
0.1mol/L Tris·
Cl(pH8.0)
缓冲液反复抽提使
之饱和并使其
pH
值达到
7.6
以上，因为酸性条件下
DNA
会分配于有机相。
（
7
）氯仿：按氯仿
:
异戊醇＝
24:1
的体积比加入 异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液
相与有机相的分开，
异戊醇则可起消除抽提过程中出现的 泡沫。
按体积
/
体积＝
1:1
混合上述
饱和酚与氯仿即得酚
/
氯仿
(1:1)
。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。
（
8
）
TE
缓冲液：
10 mmo/L Tris·
Cl
（
pH8.0
）
，
1mmol/L EDTA (pH8.0)
。高压灭菌后储存
于
4
℃冰箱中。
（
9
）电泳所用试剂：①
TBE
缓冲液（
5×
）
：称取
Tris 54g
，硼酸
27.5g
，并加入
0.5M
EDTA
（< br>pH8.0
）
20mL
，定溶至
1000mL
。②
上样缓冲液（
6×
）
：
0.25%
溴酚蓝，
40%
（
w/v
）
蔗糖水溶液。
四、操作步骤
1
、大肠杆菌的培养和质粒的扩增
2
、质粒
DNA
的提取
（
1
）
取
1-5
ml
过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，
12,000
rpm(~13,400×
g )
离心
1
分钟，尽量吸除上清（ 若菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀
收集到一个离心管中）
。
（
2
）向留有菌体沉淀的离心管中加入
250
μl
溶液
1
（请先检查是否已加入
RNaseA
）
，
使用移液器或涡 旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
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