减肥药反弹临床基因扩增检验实验室工作规范.doc

2021年2月2日发(作者：昆明最好的妇科医院)
临床基因扩增检验实验室工作规范

为使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地 为疾病的预防、诊断和治疗服务，保证检
验质量，特制定本规范。


一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理


临床基因扩增检验实 验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》
(
卫
医发
[ 2002]10
号文
)
附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。为避免污染， 必须严
格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。

临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。
各区域都
必须 有明确的标记，
以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同
的工作区 域间设备物品发生混淆。
进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，
即只能从
试剂 贮存和准备区、
标本制备区、
扩增反应混合物配制和扩增区
(
简称扩增区)
至产物分析区，
避免发生交叉污染。
在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显 区别标志的工作服，
以便于
鉴别。此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出 。

清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，
因此实验室的清洁应按试剂贮存和准 备区至扩
增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。

(
一
)
试剂贮存和准备区


下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。

贮存试 剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，
不能经过产物分析区。
在
打 开含有反应混合液的离心管或试管前，
应将其快速离心数秒。
试剂原材料必须贮存在本区
内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备
用，避免由 于经常打开反应管吸液而造成污染。

含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒 。
大多数用于扩增的试剂都应冰冻
贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分 装冰冻贮存试剂溶液。贮存试
剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。
主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查，
评价结果必 须
有书面报告。对于

热启动

技术
(
在第一个高温变 性步骤后加入酶
)
，聚合酶也可不包含在主
反应混合液中。

在整个 本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性
帽子也是一个有效地 防止污染的措施。

严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经高压处理。

工作结束后必须立即对工作区进行清洁。
本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠的化
学物 质的消毒清洁作用。
实验台表面的紫外照射应方便有效。
由于紫外照射的距离和能量对
去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯
(254nm
波长
)
，在工 作完成后调至实验台
上
60~90cm
内照射。由于扩增产物仅几百
bp，对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片
段必须延长照射时间，最好是照射过夜。实验室及其设 备的使用必须有日常记录。

(
二
)
标本制备区


下述操作在该区进行：临床标本的保存，核酸
(RNA
、
DNA)
提 取、贮存及其加入至扩增反应
管和测定
RNA
时
cDNA
的合成。< br>
要正确使用加样器。
由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，
所以应 避免在本区内
不必要的走动。
可通过在本区内设立正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染 。
为避免
样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传 染危
险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。

用过的加样器吸头必须放入专 门的消毒
(
例如含次氯酸钠溶液
)
容器内。实验室桌椅表面每次
工作 后都要清洁，实验材料
(
原始血标本、血清标本、提取中的标本与试剂的混合液等
)< br>如出
现外溅，则必须分别处理并作出记录。

对实验台适当的紫外照射
(254nm
波长，与工作台面近距离
)
适合于灭活去污染。可移动紫外
线管 灯可用来确保工作后对实验台面的充分照射。

样本处理对核酸扩增有很大影响，
必须 使用有效的核酸提取方法，
可在开展临床标本检测前
对提取方法进行评价。

用于
RNA
扩增检测的样本制备好以后，应立即进行
cDNA
合成，因为cDNA
链较
RNA
稳
定，保存相对容易。为保证逆转录反应的需要，应 在标本制备区设置一个以上的温育装置。

cDNA
合成的理想温度依所使用的酶而定 ，倾向于使用一步法：即使用在扩增反应缓冲液条
件下具有逆转录活性的热稳定的
DNA
聚合酶进行逆转录，其较
cDNA
合成后再开盖以调节
缓冲液或加入聚合酶进行扩增 发生污染的可能性降低。

待测
RNA
的
cDNA
拷贝须保 存在标本制备区，不得在本区对样本进行
PCR
扩增。

(
三
)
扩增区


下述工作在本区内进行：
DNA
或
cDNA
扩增。
此外，
已制备的
DNA
模板和合成的
cDNA(
来
自样本制备区
)
的加入和主反应混合液< br>(
来自试剂贮存和制备区
)
制备成反应混合液等也可在
本区内进行。在 巢式
PCR
测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有
较高的污染 危险性，第二次加样必须在本区内进行。

不能从本区再进入任何

上游

区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。

为避免气溶胶所致的污染，应 尽量减少在本区内的走动。如有加样则应在超净台内进行。打
开预处理过的反应混合液时必须防止液体溅 出，
尤其是在巢式扩增步骤之间。
一个简单的方
法是在打开反应管前快速离心数秒。可 使用体积较小的离心机，因其所占实验台面小，易于
用一只手操作，适合于大多数超净台。防潮屏障如石 蜡油或轻矿物油也具有防污染作用，但
必须注意的是，
矿物油本身也可能成为一种持续性的污染 源。
用过的加样器必须注意清洁消
毒。

完成操作及每天工作后都必须对实验 室台面进行清洁和消毒，紫外照射方法与前面区域相
同。如有溶液溅出，必须处理并作出记录。

(
四
)
扩增产物分析区


下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。

核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如 膜上或微孔板上探针杂交方法
(
同位素标记或非同
位素标记
)
、琼脂 糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、
Southern
转移、核酸测序方法等。目
前国 内的商品试剂盒绝大部分均采用非同位素标记的微孔板上探针杂交方法，即
PCR- ELIS
A
方法，也有膜上探针杂交方法。

本区是最主要的扩增产物污染来 源，
因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物
带出。在使用
PCR- ELISA
方法检测扩增产物时，必须使用洗板机洗板，废液必须收集至
1
mol/L
HC1
中，并且不能在实验室内倾倒，而应至远离
PCR
实验室的地方弃掉。 用过的吸
头也必须放至
1mol/L
HCl
中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。

由于本区有可能会用 到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、
丙烯酰胺、
甲醛或同位素
等，故应注意实 验人员的安全防护。

本区的清洁消毒和紫外照射方法同前面区域。本区如采用负压条件或减压 情况下
(
如安装排
风扇
)
可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可 能性。

二、临床基因扩增检验实验室质量保证


临床基因扩增检 验实验室质量保证涉及到整个基因扩增检验的所有阶段，
即测定分析前的标
本采集处理、测定中 的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。

(
一
)
标本的采集


常用于基因扩增检测的临床 标本包括
EDTA
或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、
脑脊液、尿及分泌物 等。采血液等样本时，应使用一次性密闭容器，如真空采血管。当使用
非密闭采样系统时，如尿、分泌物 和骨髓的采样，必须注意防止来自采样者的皮屑或分泌物
的污染。采样时必须戴一次性手套。

玻璃器皿在使用前应高压处理，
因为玻璃器皿常含有不易失活的
RNA
酶。< br>最好是热灭菌，
2
50
℃烘烤
4
小时以上可使
RNA
酶永久性失活。

全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。
EDTA
和枸 橼酸盐是首选的抗凝剂。
不能使用肝素抗凝，
因为肝素是
Taq
酶的强抑制剂 ，而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。

临床用于
RNA(
如
HCV
RNA)
扩增检测的血标本建 议进行抗凝处理，并尽快
(3
小时以内
)
分
离血浆，以避免
RNA
的降解。如未作抗凝处理，则抽血后，必须在
1
小时内分离血清。

(
二
)
标本的稳定化处理


用于
DNA
扩增检测的标本，采集后一般不需要特殊的稳定化处理，但标本应及时送至实验
室。

由于
RNA
易受
RNA
酶的降解，因此用于
RNA
测定的标本有时必须进行稳定化处理，如流
行病学调查的现场采样。异硫氰酸胍盐
(Guani dine
thiocyanate,GITC)
可使
DNA
酶和
R NA
酶立即失活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按
1:4
的比例加至 含有
5mol/
L
GITC
的试管中，从而使血清
(
浆< br>)
中的
RNA
酶不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本一
般不需要冷 藏即可邮寄。对于特定的检测项目，上述稳定化处理方法的效果究竟如何，要使
用相应的逆转录
PCR
测定方法来评价。

(
三
)
标本的运送


标本采集后必须尽快送至实验室。
经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运 送。
如
用于
DNA
扩增检测的
EDTA
抗凝全血标本及用于
RNA
扩增检测的经
GITC
稳定化处理的
标本。通常在运送时，应 采用不易破碎的容器装载标本。用于
RNA
检测的标本，如果未经
稳定化处理，则必须 速冻后，放在干冰中运送。

(
四
)
标本的贮存


临床体液标本如血清
/
血浆等可于
-70
℃下长时间贮存。用于DNA
测定的已纯化核酸样本可
在
10mmol/L
Tris-1
mmol/L
EDTA
缓冲液
(pH
7.5-8.0)
中
4
℃保存。用于
RNA
测定的已纯
化核酸样本应在缓冲液中
-80
℃或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在
-20
℃即可。用
G ITC
处理的
RNA
标本在室温可保存
7
天。

(
五
)
标本的处理
(
核酸提取
)
标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤，
在使用商品核酸提取试剂提取
临床标本中的核酸模板前，应对其进行充分评价以验证其提取的有效性。通常，核酸制备质
量不高是由于 抑制物去除不完全所致，抑制物可能来源于标本本身
(
如血红素及其前体或降
解产物< br>)
或核酸提取过程中残留的有机溶剂
(
如酚、
氯仿等
)
，
这些物质对其后的
Taq
酶扩增反
应步骤具有强烈的抑制作用，从而影响 靶核酸的扩增测定。当标本为痰时，则必须先进行液
化处理，再提取核酸。需注意的是，液化时不能加热 ，液化时间不能过长。此外，当靶核酸
为
RNA
时，
逆转录
PCR< br>测定失败的常见原因是标本在运送前未经充分的稳定化处理及核酸
提取试剂的
RNA酶的污染。
对于前者，
要核查测定分析前的步骤，
如果发现有
RNA降解的
证据，实验室则应拒绝接受标本，要求重新采取标本，并对运送者给以详细的指导。对于后< br>者，建议使用高质量的商品核酸提取试剂。

(
六
)
靶核酸的逆转录
(RT)
和扩增


1
、靶
RNA
的逆转录


cDNA
合成 为逆转录
PCR
中的第一个酶反应步骤，
所产生的
cDNA
为靶RNA
的反向互补链，
为后面扩增的模板。下述因素通常影响
cDNA
合 成的效率：
(1)
逆转录效率的降低或完全缺