网膜炎DNA分子标记技术在农作物种子纯度检验中的应用

2021年2月2日发(作者：米勒费雪症候群)
DNA
分子标记技术在农作物种子纯度检验中的应用

摘要：

种子是重要的农业生产资料，种子纯度是保证农作物品种增产潜力得以发挥的关键

因 素，
开展种子纯度鉴定对保证种子质量具有重要意义。随着现代分子生物学的发展，
DNA
分子
标记技术在种子纯度鉴定上的应用越来越广泛。
本文通过对

RFLP
、
RAPD
、
AFLP
和

SSR
等几种常用的分子标记技术的原理及其在种子纯度鉴定上的应用，
分析了各技术的优缺

点，
为种子纯度鉴定技术的选择提供依据。



种子是农业生产最基本的生产资料，
种子质量的优劣直接影响到农业生

产，
而在衡量种子
质量的纯度、净度、发芽率和水分四项指标中，纯度最为重

要。品种纯度检验包括两方面
的内容，即种子的真实性和品种纯度。种子的真

实性是指一批种子所属品种、种或属与文
件描述是否相同。品种纯度是指品种

个体与个体之间在特征特性方面典型一致的程度，用
本品种的种子数（或株、

穗数）占供检验本作物样品种子数的百分率表示

[1]
。品种真实
性和品种纯度是

保证良种优良遗传特性得以充分发挥的前提，是正确评定种子等级的重要
指

标。


品种纯度检验的方法很多，根据其所依据的原理不同主要可分为形态鉴

定、物理化学法鉴
定、生理生化法鉴定、分子生物学方法鉴定和细胞学方法鉴

定。形态鉴定分为籽粒形态测
定、种苗形态测定和植株测定。
籽粒形态测定虽然简单快速，< br>但仅适合于籽粒较大、形态性
状丰富的作物，测定结果受主观影

响较大。种苗形态测定，适合于十字花科、豆科等幼苗
形态性状丰富的作物，

而且苗期所依据的性状有限，测定结果不太准确。植株形态测定依
据的性状较

多，
测定结果较准确，
但测定需要时间长，
难以满足快速测定的需要。
物理 化

学
方法虽然测定速度快，但其区别的种类较少，难以满足品种纯度准确测定的

要求。生理生
化法包括的技术较多，如愈创木酚染色法、蛋白质或同工酶电泳

法、免疫技术鉴定等，其
中电泳法可以相对准确地测定品种纯度，是目前品种

纯度测定中较为快速准确的方法。细
胞学方法主要依据染色体数量和结构变

异、染色体带型差异以及细胞形态的差异区分种及
品种，在品种纯度测定中应

用价值不大。


分子生物学方法是

20
世纪

90
年代迅速发展起来的，分子生物学方法种类

非常多，根据
国际植物遗传资源研究所

Karp
等（
1997
）
的分类方法，将目前应

用的

DNA
分子技术分
为

3
类：非

PCR
技术、随机或半随机引物

PCR
技术、特异

PCR
（目标位点

PCR
）技
术。目前在品种检测中最常用的分子技术主要有

RFLP
技

术

(Restriction
Fragment
Length
Polymorphism)
、

RAPD
技

术

(
Random
Amplified
Polymorphisimic
DNA)
、

AFLP
技

术

(Amplified
Fragment
Length
Polymorphism)
以
及

SSR
技
术
(Simple
Sequence Repeat)
。
分子标记是在

DNA
水

平上对基因型的标记，
直接以

DNA
形式表现，
数量多、多态性高，在植物的各

个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境限制，
不存在表达与否的问

题。而且许多分子标记表现为显性或共显性，能够鉴别出纯合和杂合
的基因

型。
分子标记技术克服了其他方法的种种问题，
又具有以上这些优点，
在品种

纯度
检验方面有着广阔的应用前景。


1
几种常用分子标记技术


1.1 RFLP
技术

RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism
，限制性片段长度多态

性
)
是

Grodzicker
等于

1974
年发明的分子标记技术，
是检测不同生物个体间基

因细微差
异的可靠方法。其原理是：生物在长期的自然选择和进化过程中，由

于基因内个别碱基的
突变以及序列的缺失、插入或重排，会造成种、属间

DNA
的核苷酸序列上出现差异，从
而使其具有不同的酶切位点，利用限制性内切酶

切割不同品种的

DNA
时，产生的

DNA
片段的数目和大小将不同，通过电泳，再

进行

Southern
转移到膜上，利用放射性同位素
(
通常为

32P)
，用该探针与支持

膜上的

DNA
杂交就能得到

DNA
的限制性片段多态性，
从而将不同品种的种子区

分开来
[2]
。


该标记是最早在

DNA
水平上用于品种鉴别和种子纯度分析的技术，
自

20
世

纪

80
年代
将

RFLP
标记应用于植物以来，目前已广泛应用于玉米、小麦、大

麦、水稻、黄瓜等作物
的品种鉴别。
Mastuura
等
[3]
利用

2
个

RFLP
克隆作为探针

对黄瓜亲本及其

F1
杂交种
进行

RFLP
分析，
结果表明该方法能够快速、
准确地

测定出

F1
杂交种的纯度。
RFLP
标
记大多数为共显性标记，
在分离群体中能区分所有可能的基因型，
并且无上位效应，
特异性
强、准确性高，但 其过程繁

琐、周期长，操作难度较大，耗费高，同时需要大量纯度较高
的

DNA
用于分

析，且常常使用同位素，危险性大。这些缺点都限制了

RFLP
标记技术
在种子纯

度及品种真实性鉴定中的应用。


1.2 RAPD
技术

RAPD(Random Amplified Polymorphisimic DNA
，
随机扩增多态性

DNA)
是

1990
年由美国科学家

Williams
和

Welsh
几乎同时采用

PCR
技术发展起来的，

它
利用随机引物
(
一般为

9
～
10
个碱基
)
对不同品种的基因组

DNA
进行

PCR
扩

增，产生
不连续的

DNA
产物，再通过电泳分离检测

DNA
序列的多态性，得到多

态性的

DNA
谱
带从而鉴别不同的品种。


RAPD
技术鉴定种子纯度的基本原理就是以该品种

RAPD
图谱中某一特异谱

带的出现
与否加以判断的
[4]
。
RAPD
应用于常规品种种子纯度检验时，
要求选择

目标品种的

RAPD
图谱中出现而其他常规品种中不出现的

DNA
谱带作为鉴定纯度

用的特异谱带。为保证检
测结果的真实性和可靠性，寻求特异谱带的研究中通

常选用较多的其他非目标常规品种。
高蓝等
[5]
用

RAPD
方法完成了对番茄种子纯

度的初步鉴定。戴修纯等
[6]
利用

RAPD
技
术鉴定两个番茄一代杂种的种子纯度，

建立了适合于番茄

RAPD
分析的程序，并从

100
个随机引物中筛选到十几个合适

的随机引物，能快速、准确地鉴定

F1
种子的纯度。刘静
等
[7]
以白菜型油菜新品

种
“
白杂

1
号
”
父母本及

F1
代种子为研究材料，
用

238
个

RAPD
随机引物对其

分析鉴定，经多次重复验证，引物

S24
、
S83
和

S104
条带稳定，并且杂
交种条

带为双亲互补型；人为掺杂构建
“
白杂

1
号
”F1
代测试群体，用

S104
对其进

行
了纯度检测，结果与预期结果基本一致。在鉴定种子纯度中运用双引物混合

扩增，也只出
现父本特异谱带，母本特异谱带没有出现，这与蒲汉丽等

[8]
的试

验结果一致。


RAPD
引物无种属特异性，一套随机引物可用于不同作物基因组分析；
RAPD
技术可以在
对物种没有任何分子生物学研究基础的情况下，进行指纹图谱的构

建及遗传多样性分析，
快速简便，无放射性污染，成本较低，分辨率高，灵敏

度强；用

RAPD
构建基因图谱不
需要克隆，
不涉及

Southern
杂交、
放射自显影

等繁琐程序，
DNA
用量极少。
但

RAPD
标
记是一个显性标记，不能区分杂合子与

纯合子，试验稳定性和重复性较差；不同引物之间
的扩增结果重复性和稳定性

相差较大，
能够稳定重复的引物相对较少，
引物筛选工作量大；
对于用已经筛

选出的适合玉米种子纯度及真实性鉴定的引物进行

DNA
指纹分析，比较方
便、

快捷、
准确，但是对于以前未检测过的新品种，要想在短时间内筛选到合适的

引物进
行鉴定，难度很大；另外，
RAPD
存在共迁徙问题，即只能分开不同长度

的

DNA
片段，
不能分开长度相同、但碱基序列不同的片段。因此，在使用此技

术的时候应注意扬长避短
[9,10]
。


1.3 AFLP
技术


AFLP(Amplified
Fragment
Length
Polymorphism
，
扩
增
片
段
长
度
多
态
性
)
标
记
是
由

Zabeaumare
发现，并由

Vospieter
等发展起来的。其基本原理是将

DNA
用可产生粘性
末端的限制性内切酶消化产生大小不同的酶切片段与含有共

用粘末端的人工接头连接，作
为进一步扩增的模板。根据需要通过选择在末端

上分别增加

1
～
3
个选择性核苷酸的不同
引物，使得引物能选择性识别具有特异

配对顺序的内切酶片段，扩增的内切酶片段通过聚