喜来健理疗床价格DNA提取及PCR扩增实验报告

2021年2月2日发(作者：心慌的原因)

PCR
扩增及
DNA
琼脂糖凝胶电泳

刘琳

1131428
环境科学


一、实验目的

1
．学习并掌握
PCR
扩增的基本原理与实验技术。

2
．对扩增后的
DNA
进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。

二、实验原理

1. PCR
扩增

多聚酶链反应
（
PCR
）
技术的原理类似于
DNA
的天然复制过程。
在微 量离心管中加入
适量缓冲液，加入微量模板
DNA
、四种脱氧核苷酸（
dNT P
）
、耐热
T
aq
聚合酶及两个合成
DNA
的引物 ，而后加热使模板
DNA
在高温下（
94
℃）变性，双链解链，这是所谓变性 阶
段。降低溶液温度，使合成引物在低温（
55
℃）与模板
DNA
互 补退火形成部分双链，这是
所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（
72
℃）
，在
Tap
酶作用下，用四种
dNTP
为原料，
引物为复制起点，< br>模板
DNA
的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，
这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和
DNA
合成这一循环，使产物< br>DNA
重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物
DNA
可作为后一循环的模 板
DNA
而参
与
DNA
的合成，使产物
DNA
的量 按指数方式扩增。经过
30
～
40
个循环，
DNA
扩增即可
完成。

2. DNA
琼脂糖凝胶电泳实验

DNA
分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度
下，
DNA< br>分子的迁移速度取决于分子筛效应，
即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
DNA
分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
不同构型的
DNA
分子的迁移速度不 同。
该电
泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用
DNA
分子在泳动时的电荷效应 和分子筛效应，达到分
离混合物的目的。

三、实验材料

仪器：< br>PCR
扩增仪、
0.2ul
薄壁管、
1.5ml
离心管、移液 枪、枪头、微波炉、电泳仪、
水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。

试剂：

TapDNA
聚合酶、
dNTP
、
buffer
、
两种引物、
16S
全长
DNA
样本、
无菌
ddH
2
O
、
模板
DNA
、
TBE
、琼脂糖、
EB
、显色剂。

四、

实验步骤

1. PCR
扩增

本次试验选择细菌
16S rDNA V3
区片段进行扩增。

1.1
根据计算，首先取
1.5ml
离心管按照
2.5ul 10
×
Buffer
、
1 ul
dNTP
、
0.5 ul 341GC
、
0.5 ul 534
、
0.125 ul Taq
、
19.375u ddH
2
O
的比例配置足量的
PCR
反应体系。

1.2
分别向
9
个薄壁管中分别加入
24 ul
的反应体 系，并分别添加
8
种不同的模版，并于第
9
个薄壁管中加入无菌
dd H
2
O
作为阴性对照。

1.3
将薄壁管放入
P CR
扩增仪中，按照预定程序进行
PCR
扩增。其中循环过程需要达到
30~ 40
次。程序如下：

预变性：


94
℃


3min
循环：




94
℃


变性
30s














55
℃


退火
30s














72
℃


延伸
30s
末次延伸：
72
℃


5min