安尔眠糖浆pcr扩增实验报告

2021年2月2日发(作者：跑步可以全身减肥吗)
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pcr
扩增实验报告





篇一：
DNA
提取及
PCR
扩增实验
报告




PCR
扩增及
DNA
琼脂糖凝胶电泳




刘琳

1131428
环境科学





一、实验目的




1
．学习并掌握
PCR
扩增的基本原
理与实验技术。




2
．对扩增后的
DNA
进行琼脂糖凝
胶电泳试验，并分析相应结果。




二、实验原理




1. PCR
扩增




多聚酶链反应（
PCR
）技术的原理
类似于
DNA
的天然复 制过程。
在微量离
心管中加入适量缓冲液，加入微量模板
DNA
、四种脱氧核 苷酸（
dNTP
）
、耐热
Taq
聚合酶及两个合成
DNA< br>的引物，而
后加热使模板
DNA
在高温下
（
94
℃）
变
性，双链解链，这是所谓变性阶段。降
低溶液温度，使合成引物在低温（
5 5
℃）
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1
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与模板< br>DNA
互补退火形成部分双链，
这
是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中
温
（
72
℃）
，
在
Tap
酶作用下，
用 四种
dNTP
为原料，
引物为复制起点，
模板
DNA
的一条双链在解链和退火之后延伸为两条
双链，这是延伸阶段。如此反复，在同
一反应体系中 可重复高温变性、低温退
火和
DNA
合成这一循环，使产物
DNA
重 复合成，并在重复过程中，前一循环
的产物
DNA
可作为后一循环的模板
DN A
而参与
DNA
的合成，
使产物
DNA
的量按指数方式扩增 。
经过
30
～
40
个循
环，
DNA
扩增即 可完成。




2. DNA
琼脂糖凝胶电泳实验




DNA
分子在 高于其等电点的溶液中
带负电，在电场中向阳极移动。在一定
的电场强度下，
DNA< br>分子的迁移速度取
决于分子筛效应，即分子本身的大小和
构型是主要的影响因素。
DNA
分子的迁
移速度与其相对分子量成反比。不同构
型的
DNA
分子的迁移速度不同。
该电泳
方法以琼脂凝胶作为支持物，利用
DNA
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分子在泳动时的电荷效应和分子筛效
应，达到分离混合物的目的。




三、实验材料




仪器：
PCR
扩增仪、薄壁管、离心
管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、
水平电泳槽、制 胶版、紫外透射仪。




试剂：

TapDN A
聚合酶、
dNTP
、
buffer
、两种引物、
16S< br>全长
DNA
样本、
无菌
ddH2O
、模板
DNA
、
TBE
、琼脂
糖、
EB
、显色剂。




四、

实验步骤




1. PCR
扩增




本次试验选择细菌
16S rDNA V3
区
片段进行扩增。




根
据
计
算
，
首
先
取
离
心
管
按
照

10×
Buffer
、
1 ul dNTP
、

ul 341GC
、

ul
534
、

ul Taq
、

ddH2O
的比例配置足量
的
PCR
反应体系。




分别向
9
个薄壁管中分别加入
24 ul
的反 应体系，并分别添加
8
种不同的模
版
，
并
于
第9
个
薄
壁
管
中
加
入
无
菌ddH2O
作为阴性对照。


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将薄 壁管放入
PCR
扩增仪中，按照
预定程序进行
PCR
扩增。其中循环 过程
需要达到
30~40
次。程序如下：




预变性：


94
℃


3min



循环：

94
℃


变性
30s



55
℃


退火
30s



72
℃


延伸
30s



末次延伸：
72
℃


5min


PCR
扩增完成后，将样品取出并保
存于
15
℃环境中。




2. DNA
琼脂糖凝胶电泳实验




称取琼脂糖粉末，
放到一锥形瓶中，
加入适量的
×TBE
电泳缓冲液。
然后置微
波炉加热至完全溶化，溶液透明。摇匀，
待 冷却至
60
℃左右，在胶液内加入适量
的
EB
。




取有机玻璃制胶板槽，在一端插好
梳子，在槽内缓慢倒入已冷至
60
℃左右
的胶液，使之形成均匀水平的胶面。




待胶凝固后，小心拔起梳子，使加
样孔端置阴极段放进电泳槽内。




在槽内加入
×
TBE
电泳缓冲液，
至液
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面覆盖过胶面。
取
1μl
缓冲液和
5μl
待测
DNA
样品混合后，用移液枪滴 加至凝胶
的加样孔中。




接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，
调节稳压输出，
电压最高不超过
5V/cm
，
开始 电泳。点样端放阴极端。根据经验
调节电压使分带清晰。



< br>观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。
当其移动至距胶板前沿约
1cm
处，可停止电泳。




在紫外透视仪的样品台上重新铺上
一 张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝
胶放在上面。关上样品室外门，打开紫
外灯，通过观察孔进 行观察。




五、实验结果与讨论




如图所示：从左至右，分别是模版




1-8
号，第
9
列为阴性对照。




前
8
列均有明显的条带出现，而阴




性对照无显示，说明扩增整体效果
很




好。图中有上下两条线，上面一条
线所


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覆盖的条带基本可以代表扩增的产
生




的片段位置，参照图可以看出扩增
片段




在
200bp
左右。在第
9
个阴性对照
的第




二条线处可以看到较为模糊的条
带，并




非是出现假阴性，而是由于二聚物
而产




生的条带。通过该条带与最右侧的




ma rker
对
比
可
知
该
片
段
出
现< br>在
100bp
左




右，并非由于实验操作等问题而产
生的




污染。




实验的照片显示实验结果有拖尾




现象，但是并不影响后续实验。在
实验




过程中由于有些试剂加到了管壁上
面，




并没有完全加入，可能会出现一些
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误




差。另外在第
1< br>列条带中出现了其
他的亮带，可能是由于在前期的扩增实
验中滴加试剂时由于量过少而进 行的摇
匀和融合等操作产生了非特异性扩增，
也有可能是因为胶板制作过程中梳子的
位 置不合适或者胶板制作时边缘处不够
均匀导致产生污染。但总体而言，实验
结果较为满意。



六、实验注意事项




1.
由于
PCR
技术非常敏感，可使一
个
DNA
分 子得以扩增，装有
PCR
试剂
的离心管打开之前，应先在微量离心机
上作瞬间 离心使液体沉积于管底。
PCR
扩增反应的条件，要控制好温度、时间
和循环次数。< br>



2.
最好在加完所有其它反应成分后
才加模板
DNA
。




3.
配琼脂糖时应使其完全溶化后方
可制胶。




具有致癌作用，配制及使用时应带
一次性手套。
并在专门的实验室内使用。

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七、实验收获




1.
通过本次实验学习并掌 握了
PCR
反应的基本原理、实验过程及技术。



< br>2.
通过本次实验掌握了电泳实验分
离
DNA
的原理和方法。




八、思考题




1< br>、
如果你的研究中要扩增大肠杆菌
某个酶的基因，你如何进行相关实验？




通过
PCR
扩增出想要的片段，然后
通过凝 胶电泳实验进行回收，并与合适
的载体连接，转化进感受态细胞。经过
培养提取质粒，进行酶切 或
PCR
验证，
测序最终验证，保存菌种




2.
一
对
引
物
序
列
为
5
‘
-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3
’
和




5
‘
-AACCGTGGCGACACCGCTAA
请 计算它们的
Tm
值及选择合适的退火
温度，如果按你算的退火温度做
PCR< br>时
没有得到相应的产物，你怎么解决？




5
‘
-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3
’




Tm
值
=4
（
G+C
）
+2-

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=4
（
3+7
）
+2
（
6+4
）
-



=60
℃
-



=50~55
℃




5
‘
-AACCGTGGCGACACCGCTAA
’




Tm
值
=4
（
G+C
）
+2 -



=4+2 -



=64
℃
-=54~59
℃




因此退火温度可以选择在
55
℃




可以通过分析几个逐步提高退火温
度的反应以提高特异性。开始低于估算
的
Tm5℃，以
2
℃为增量，逐步提高退
火温度。较高的退火温度会减少引物二
聚 体和非特异性产物的形成。为获得最
佳结果，两个引物应具有近似的
Tm
值。
引物对的
Tm
差异如果超过
5
℃，
就会令
引物在循环中使用 较低的退火温度而表
现出明显的错误起始。
如果两个引物
Tm
不同，将退火温 度设定为比最低的
Tm
低
5
℃

或者为了提高特异性，可以 在根
据较高
Tm
设计的退火温度先进行
5
个
循环，然后在根 据较低
Tm
设计的退火
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温度进行剩余的循环。这使得在较为严
紧的条件下可以获得目的模板的部分拷
贝 。



篇二：
PCR
实验报告




普通生物学实验报告




实验名称：用
PCR
扩增的方法鉴别
不同物种来源的肌肉




一、特异性目的片段
DNA
的扩增




（一）实验原理




聚合酶链式反应（
Polymerase Chain
Reaction,PCR< br>）
是
体
外
酶
促
合
成
特
异< br>DNA
片段的一种方法，其基本原理为
DNA
的半保留复制。
PCR< br>技术由①高温
变性模板

；②引物与模板退火；③引物
沿模板延伸这< br>3
步反应组成一个循环，
通过多次循环反应，
目的
DNA
得以 迅速
扩增。
其主要步骤是：
将模板
DNA
置于
高温下（通常 为
93
℃
-94
℃）
，使其变性
解成单链；人工合成的两个 寡核苷酸引
物在其合适的复性温度下分别与目的基
因的两条单链互补结合；
热稳定DNA
聚
合酶（
Taq
酶
)
在
72
℃ 将单核苷酸从引物
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