雪象医院DNA甲基化实验操作原理及方法-Hxg

2021年2月2日发(作者：治脱发)

DNA
甲基化重亚硫酸氢盐修饰法（
DNA
METHYLATION BISULFITE MODIFICATION
）

实验操作原理及方法


一、实验目的：

通过本实验，可以检测特定
DNA
序列的甲基化状态。

二、实验原理：

DNA
甲基化是指由
S-
腺苷甲硫氨酸
（
SAM
）
提供甲基基团，
在
DNA
甲基转移酶
（
DNA
methyltransferases
，< br>DNMTs
）的作用下，将
CpG
二核苷酸的胞嘧啶（
C
） 甲基化为
5-
甲基
化胞嘧啶（
5-m
C
）的一种化学反应。
DNA
甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗
传的修饰方式。

DNA
甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。
DNA
甲基化引起基因转录抑制的机制
可能主要有以下
3
种：
（
1
）
DNA
甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位
置的结合 。
（
2
）序列特异性的甲基化
DNA
结合蛋白与启动子区甲基化
CpG
岛结合，募集
一些蛋白，
形成转 录抑制复合物，
阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，
从而影响基因的
转录。
（
3
）
DNA
甲基化通过改变染色质结构，抑制基因表达。
< br>重亚硫酸氢盐修饰法检测
DNA
甲基化的基本原理是基于
DNA
变性后 用重亚硫酸氢盐
处理，可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。此反应的步骤是：
1
、在< br>C-6
位点磺化胞嘧啶残
基；
2
、在
C-4
处水解去 氨基来产生尿嘧啶磺酸盐；
3
、在碱性条件下去硫酸化。在这个过程
中，
5-
甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到
C-6
位点而保持着未反应的状
态。在重亚硫酸氢盐处理后，使用针对每个修饰后
DNA
链的引物进行
PCR
反应。在这个
PCR
产物中，每
5-
甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶，而由 未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩
增过程中被胸腺嘧啶所取代。

BSP(bisulfate
sequencing
PCR)
：重亚硫 酸盐使
DNA
中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨
基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不 变，进行
PCR
扩增。最后，对
PCR
产物进行
测序，并且与未经处 理的序列比较，判断是否
CpG
位点发生甲基化。



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