两次胎停大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计

2021年2月2日发(作者：男子医院)
大肠杆菌基因组
DNA
的提取

一、传统法提取大肠杆菌基因组
DNA
。

1
、实验原理

提取
DNA
的一般过程是将分散好的组织细 胞在含十二烷基硫酸钠（
SDS
）
和蛋白酶
K
的溶液中消化分解蛋白 质，再用酚和氯仿
/
异戊醇抽提分离蛋白质，
得到的
DNA
溶液经乙 醇沉淀使
DNA
从溶液中析出。

SDS
的作用机理是由于其能结合 蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共
价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶
K
或链霉蛋白酶
E
均为
光谱蛋白酶，其重要特性是能在
SDS
和
EDTA
（乙二胺四乙酸二钠）存在的情
况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA
的反应体系中，
SDS
可通过失活蛋
白破坏细胞膜、核膜，并使组 织蛋白和
DNA
分离；而蛋白酶
K
可将蛋白质降
解成小肽或氨基酸， 使
DNA
分子完整地分离出来。用酚、酚
/
氯仿抽提除去蛋
白质，最 后用无水乙醇沉淀
DNA
。为获得高纯度
DNA
，操作过程中常加入
RNaseA
除去
RNA
。
CTAB
（十六烷基三乙基溴化铵）是一 种去污剂，可溶解
细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（
0.7 mol/L NaCl
）是可溶的，
当降低溶液盐浓度到一定的程度（
0.3 mol/L NaC l
）时，从溶液中沉淀，通过离
心就可将
CTAB-
核酸的复合物与蛋白，多 糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇
沉淀
DNA
，而
CTAB
溶于乙 醇或异丙醇而除去。

2
、实验试剂与仪器

1
）实验材料：大肠杆菌

2
）实验试剂：

LB
液体培养基，
TE
溶液，
10%SDS
，蛋白酶
K
，
5mol/L NaCl
，
CTAB/NaCl
溶
液，酚
/
氯仿
/
异戊醇，异丙醇，
70%
乙醇

3
）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅

3
、溶液配制

1
）
LB
液体培养基：细菌培养用胶化蛋白胨
10 g/L
，细菌培养用酵母提取物
5
g/L
，
NaCl 10g/L
，去离子水。

(
搅拌溶解后，用
5mol/LNaO H
调
pH
至
7.0.
用去离子水定容
100ml
， 用
20/50ml
摇瓶分装
5
瓶，包扎好，在
121
℃，< br>1.034×
105 pa
高压下蒸汽灭菌
20min.)
2
）
TE
缓冲液：

1M Tris
溶液（取< br>Tris242.2g
，加
ddH
2
O
至
1600m l
，加热溶解）

1M tris-HCl pH8.0
溶液（取
1M Tris
溶液
160ml
用分析纯盐酸调至
Ph=8.0
（ 需
浓盐酸约
8.5ml
），加
ddH2O
定容至
200ml
，高压灭菌备用）

TE
缓冲液（
10 mM Tris-HCl 1Mm EDTA pH=8.0
，
1M Tris-HCl Buffer PH=8.0
5ml
0.5M EDTA PH =8.0 1ml
向烧杯中加入约
400mldd H
2
O
均匀混合
;
将溶液定
容到
500ml
后，高温高压灭菌，室温保存）

3
）蛋白酶
K
：（
20mg
蛋白酶
K
溶于
1ml
无菌双蒸水，
-20
℃备用）

4
）
CTAB/NaCl
溶液：（
5% w/v
，
5gCTAB
溶于
100ml 0.5M NaCl
溶液中，需加
热到
65
℃使之溶解，然后室温保存）

4
、实验方法步骤

1
、将大肠杆菌接种到灭菌好的
LB< br>培养基中，一级培养过夜，以
10%
的接种量
进行二级培养，培养至对数期（< br>4-6h
）。

2
、取菌液
1.5ml
置于离心管中 ，以
5000rpm
冷冻离心
1min
，弃上清液

3
、加
190 ul TE
悬浮沉淀，并加
10 ul 10%SDS,
摇匀直至溶液变粘稠

4
、加入
1ul
蛋白 酶
K
（
20mg/ml
），混匀，
37
℃保温
1< br>小时。

5
、加
30ul 5 mol/L NaCl,
混匀。

6
、加
30ul CTAB/NaCl
溶液，混匀，
65
℃保温
20min
7
、加入
300ul
酚
/
氯仿
/
异戊醇抽提（
25
：
24:1
），
5000rmp
离心
10min
8
、取上清液，加入
300ul
氯仿
/
异戊醇（
24:1< br>）抽提，
5000rmp
离心
10min
9
、取上清液，加 入
300ul
的异丙醇，颠倒混匀，室温下静止
10min
，沉淀
D NA
，
5000rmp
离心
10min
10
、加
500ul 70%
乙醇洗沉淀，
5000rmp
离心
10min
11
、弃上清液，待酒精挥发尽后加
30ulTE
溶解

12
、溶解于
20ul TE
中，
-20
℃保存。

二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组
DNA
。

细菌基因组
DNA
提取试剂盒：

1
、
TGuide
细菌基因组
DNA
提取试剂盒

DP302-02 50
次
420
元

2
、
TaKaRa
细菌基因组
DNA
小量纯化试剂盒

TaKaRa DV810A 50 650
元

3
、
Biomiga
细菌基因组
DNA
提取试剂盒

GD2411-01 Bacterial gDNA kit 50
次
423
元

GD2411-02 Bacterial gDNA kit 250
次
1798
元

4
、
Biospin
细菌基因组
DNA
提取试剂盒

BSC12S1 50
次
400
元

BSC12M1 100
次
750
元

5
、
OMEGA
细菌基因组
DNA
提取试剂盒

D3350-00 Bacterial DNA kit 5 210
元

D3350-01 Bacterial DNA kit 50 980
元

D3350-02 Bacterial DNA kit 200 3350
元


荧光定量
PCR
试验（标准曲线法）

定量实验是一种实时实验，用于在聚合酶链反应

(PCR)
的每个扩增循环期
间测定靶核苷酸序列

（靶）数量。其中靶可以是
DNA
、
cDNA
或
RNA
。

【实验原理】

在实时定量实验中，反应是在
PCR
产物的扩增 达到固定荧光水平时的循环
期间时间点来描述的，而不是在固定循环次数后累积的
PCR
产物最终数量来描

述
。
扩
增
曲
线
以
图
形
形
式
显
示
在
执
行
的
循
环
次
数
中
检
测
到
的
荧
光
。


在

PCR
的最初几次循环中，荧光信号没有明显变化。该预定义的

PCR
循环
范围称为基线。首先，软件通过计算归一化报告荧光信号强度

（与基线循环相
对应的

Rn
值）的数学趋势，生成一个基线简化 扩增曲线。然后，算法将搜索
扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度

（

delta
Rn
[?Rn]
值）与阈值
交叉的点。

?Rn
值与阈值交叉的分数循环定义为
CT
。

一、试验设计

使用
StepOne
软件中的
Design Wizard
（
设计导向）创建新实验

1
、定义实验属性

在

Experiment
Properties

（实验属性）屏幕上，输入实验的标识信息，然
后选择要设计的实验类型。

1
）
Experiment Name

（实验名称）。

2
）
Barcode

（条码），然后输入您的
PCR
反应板上的条码。（可不填）

3
）
User Name
（用户名）。

4
）
Comments
（注释）。（可不填）

5
）选择

Quantitation
（定量）实验类型

6
）
Next>
（下一步）

2
、定义方法和材料

在

Methods
&
Materials
（方法和材料）屏幕上，选择用于实验的定量方
法、试剂、升降温速度和
PCR
模板。

1
）将

Standard Curve
（标准曲线）选为定量方法。

将

Standard
Curve
（标准曲线）选为定量方法。

标准曲线实验确定样本
中靶序列的绝对量。

从已知量的稀释序列中构建的标准曲线用于归档结果。

当
设置反应板时，标准曲线方法需要靶、标准品和样本。

用于标准曲线实验的
PCR
反应包括以下组分：

?
样本

－

其中靶数量未知的样本。

?
标准品

－

数量已知的样本。

?
标准品稀释序列

－

一组用于构建标准曲线的标准品稀释液

（例如，
1:2
、
1:4
、
1:8
、
1:16
、
1:32
）

。

?
重复数

－

含有相同组分和量的相同反应数。

?
阴性对照

－

含有水或缓冲液的样本，不含模板；也称为

“
无模板对照

(NTC)”
。阴性对照应不会扩增。

2
）为试剂选择

TaqMan
?
Reagents
（
TaqMan
试剂）（包括两个引物一个
探针）

。

–
如果使用

TaqMan
试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选择

TaqMan
?
Reagents
（

TaqMan
试剂）

。

TaqMan
试剂包括两个引物和一个

TaqMan?
探针。

引物设计用于扩增靶。

TaqMan
探针设计用于杂交靶，并

在扩增靶时产生荧光信号。

切记！

Applied
Biosystems
不建议将

TAMRATM
染料随

StepOneTM
系统
用作荧光报告基团或淬火基团。

–
如果使用

SYBR
Green
试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选

择

SYBR
?
Green Reagents
（
SYBR Green
试剂）。
SYBR Green
试剂包括两

个引物和

SYBR
Green
染料。

引物设计用于扩增靶。

SYBR
Green
染料可在

结合到双链

DNA
时产生荧光信号。

SYBR
Green
染料通常是添加到反应的

SYBR
Green
母
液
的
一
部
分
。

如
果
使
用

SYBR
Green
染
料
：

选择

Include
Melt
Curve
（包括解链曲线）以执行扩增靶的解链曲线分析。

将

Standard
（标准）选为升降温速度。

Applied
Biosystems
不提供

SYBR
Green
试剂的
Fast
母液。

3
）为升降温速度选择

Standard (~2 hours to complete a run)
（标准

（约两
小时完成运行））

。

–

如
果
为

PCR
反
应
使
用

Fast
试
剂
，
则
选
择

Fast
(~40
Minutes
to

Complete a Run)
（快速

（约
40
分钟完成运行）

）。


–

如果为

PCR
反应使用标准试剂

（包括

SYBR
Green
试剂和

TaqMan
试
剂）

，则选择

Standard (~2 Hours to Complete a Run)
（标准

（约
2
小时完成
运行））

。

4
）为模板类型选择

gDNA
(genomic
DNA)
（
gDNA
（基因组
DNA
）

）

。

5
）
Next>
（下一步）

。

3
、设置靶

在
Targets
（靶）屏幕上，输入您想在
PCR
反应板中定量的靶数量，然后
为每个靶设置检测。

1
）单击

How many targets do you want to quantify in the reaction plate?
（您想在反应板中定量多少靶？）字段，然后输入

1
（根据需要填）。

注意：

靶检测表中的行数将以您输入的数字更新。

2
）选择

Set Up Standards
（设置标准品）复选框，以为靶检测设置标准品。

建议反应板中的每个靶检测设置一条标准曲线。

注意：
Set Up Standards
（设置标准品）复选框默认情况下已选取。

3
）设置靶
1
检测：

a.
单击

Enter
Target
Name
（输入靶名称）单元格，然后输入

RNase
P
（示例）
。

b.
从
Reporter
（报告基团）下拉菜单中，选择

FAM
（默认）

。

–

如果要将
FAMTM
染料加在您用于检测靶的
TaqMan
探针的

5′
端，则选
择
FAM
。

–

如果要将
JOETM
染料加在您用于检测靶的
TaqMan
探针的

5′
端，则选择
JOE
。

–

如果要将
VIC?
染料加在您用于检测靶的
TaqMan
探针的

5′
端，则选择
VIC
。

–

如果您正使用
SYBR? Green
染料以检测双链
DNA
，则选择

SYBR
。

c.
从
Quencher
（淬火基团）下拉菜单中，选择

NFQ-MGB
（默认）

。

–

如果要将非荧光淬火基团－小沟结合物加在您正用于检测靶的
TaqMan
探针的

3′
端，则选择

NFQ- MGB
。

–

如果您正使用
SYBR Green
染料，则选择

None
（无）

。

4
）
Next>
（下一步）

。

4
、设置标准品

在

Standards
（标 准品）屏幕上，为所有标准曲线输入反应板中的点数和
重复数。对于每条标准曲线，输入起始量并选择序 列倍数。

1
）单击

How many points do you need for each standard curve?
（每条标
准曲线您需要多少个点？）字段，然后输入

5
。

建议每条标准曲线应至少有五个稀释点。

2
）单击

How many replicates do you need for each point?
（每个点您需要
多少次重复反应？）字段，然后输入

3
。

建议每个点三次重复反应。

3
）为
RNase P
（示例）检测定义标准品数量范围：

a.
单击

Enter Starting Quantity
（输入起始量）字段，然后输入

10000
。

由于标准 品数量的范围会影响扩增效率计算，因此应仔细为您的检测考虑
标准品数量的适当范围：

–

为了更准确地测量扩增效率，请使用大范围的标准品数量，扩大到

5
个
至
6
个对数级之间。

如果您为标准品指定大范围的数量，您需使用

PCR
产物
或高度浓缩的模板，如
cDNA
克隆。

–

如果您的

cDNA
模板数量有限且
/或靶是低拷贝数转录物，或已知在给定
范围之内，则可能需要小范围的标准品数量。

b.
从
Select Serial Factor
（选择序列倍数）下列菜单中，选择

1:2
。

序列倍数用于计算标准曲线所有点中的数量。

如果您的起始数量是最高数

量，则选择如
1:2
、
1:3
之类的稀释倍数。

如果您的起始数量是最低数量，则选
择如
2X
、
3X
之类的浓缩倍数。

4
）查看

Standard
Curve
Preview
（标准品曲线预览）窗格。

标准曲线应包
含如下点：
10000
、
5000
、
2500
、
1250
和
625
。

5
）
Next>
（下一步）

。

5
、设置样本

在

Samples
（样本）屏幕上，输入反应板中要包括的样本、重复数和阴性
对照数，然后选择样本
/
靶反应以进行设置。

1
）单击

How many samples do you want to test in the reaction plate?
（您
想在反应板中检测多少样本？）字段，然后输入

2
。（根据需要填）

2
）单击

How many replicates do you need?
（您需要多少次重复反应？）
字段，然后输入

3
。

建议对每个样本反应重复三次反应。

3
）单击

How many negative controls do you need for each target assay?
（每个靶检测您需要多少阴性对照？）

，然后输入

3
。

建议对每个靶检测进行三次阴性对照反应。

4
）
4.
设置样本
1
：

a.
单击

Enter
Sample
Name
（输入样本名）字段，然后输入

pop1
（用于
重复组
1
）

。

b.
保留
Color
（颜色）字段中的默认设置。

5
）设置样本
2
：

a.
单击

Enter
Sample
Name
（输入样本名）字段，然后输入

pop2
（用于
重复组
2
）

。

b.
保留
Color
（颜色）字段中的默认设置。

6
）选择

All Sample/Target Reactions
（所有样本
/
靶反应）以检测所有样本
中的所有靶。

–

选择

All
Sample/Target
Reactions
（所有样本
/
靶反应）以检测所有样本
中的所有靶。

–

选择

Specify
Sample/Target
Reactions
（指定样本
/
靶反应）以指定每个
样本中要检测的靶。

7
）在
Well Count
（反应孔数）窗格中，确认存在：

? 6
个未知反应孔
U
? 15
个标准品反应孔
S
? 3
个阴性对照反应孔
N
? 24
个空反应孔

8
）在
View Plate Layout
（查看检测板布局）选项卡上：

a.
从
Arrange Plate by
（反应板布局方式）下拉菜单中，选择

Rows
（按行）

（默认）

。

b.
从

Place
Negative
Controls
（放置阴性对照）下拉菜单中，选择

Upper
Left
（左上角）

（默认）

。

9
）
Next>
（下一步）

。

6
、设置运行方式

在

Run
Method
（运行方法）屏幕上，查看默认运行方法的反应体积和温
度变化过程设置。

若需要，您可调整默认运行方法或用

Run
Method
（运行方
法）库中的某种方法进行替换。

1
）单击选择

Graphical
View
（图形视图）选项卡

（默认）或

Tabular
View
（表格视图）选项卡。

2
）单击

Reaction Volume Per Well
（每个反应孔的反应体积）字段，然后
输入

25
?
L
。

为

“
反应体积
/
反应孔
”
输入介于

10
至

30
的值。

StepOne
系统支持

10
至

30 ?
L
之间的反应体积。

3
）确保温度变化过程设置显示保持和循环阶段。

–

确保温度变化过程设置适合试剂。

–

如
果
正
执
行
一
步
法

RT-PCR
扩
增
，
则
包
括
一
个
反
转
录
步
骤
。

如果实验需要一个不同的温度变化过程设置，调整温度变化过程设置或用

Run
Method
（运行方法）库中的某个温度变化过程设置进行替换。

Run
Method
（运行方法）库包括在
StepOne
软件中。

4
）
Next>
（下一步）

。

7
、查看反应设置

在

Reaction
Setup
（反应设置）屏幕上，选择检测类型

（如果使用

TaqMan
试剂），然后查看为准备

PCR
反应、标准稀释序列和样本稀释而计算
的剂量。

若需要， 您可调整反应体积、额外反应体积、组分浓度、标准品浓度
和
/
或稀释后样本浓度。< br>
切记！

对反应板中的每个靶检测执行这些步骤。

完成
Reaction Mix Calculations
（反应预混液计算）选项卡

1
）选择
Reaction Mix Calculations
（反应预混液计算）选项卡

（默认）。

2
）从
Select Target
（选择靶）窗格中，选择

RNase P
。

3
）从

Assay
Type
（检测类型）下拉菜单中，选择

Inventoried/Made
to
Order
（库存
/
定制）

。

如果正使用
TaqMan
试剂，选择所使用的检测类型：

–

如果正使用
Applied Biosystems TaqMan? Gene Expression Assays
（库存
/
定制）或

Applied
Biosystems
Custom
TaqMan?
Gene
Expression
Assays
，则

选择

Inventoried/Made to Order
（库存
/
定制）。

–

如
果
正
使
用

Primer
Express?
软
件
设
计
检
测
，则
选
择

Custom

（定制）。


4
）确认

Reaction
Volume
Per
Well
（每个反应孔的反应体积）字段中显示

25 ?
L
。

为

“
反应体积
/
反应孔
”
输入介于

10
至

30
的值。

StepOne
系统支持

10
至

30 ?
L
之间的反应体积。

5
）确认
Excess Reaction Volume
（额外反应体积）字段中显示

10%
。

包括额外反应体积以弥补移液过程中的损失。建议至少准备

10%
的额外反
应体积。

6
）在
Reactions for RNase P
（
RNase P
反应）窗格中：

a.
确认
Master Mix Concentration
（母液浓度）字段中显示

2.0
X
。

b.
确认
Assay Mix Concentration
（检测预混液浓度）字段中显示

20.0
X
。

c.
查看
PCR
反应的组分和计算的剂量。

7
）在
Standard Dilution Series for RNase P
（
RNase P
的标准品稀释序列）
窗格中：

a.
单击

Standard Concentration in Stock
（储液中标准品的浓度）字段，然
后输入

20000
。

b.
单击
units
（单位）字段，然后输入

copies
per ?
L
。

c.
查看为准备标准品稀释序列计算的剂量。

完成
Sample Dilution Calculations
（样本稀释计算）选项卡

1
）选择

Sample Dilution Calculations
（样本稀释计算）选项卡。

2
）单击

Diluted Sample Concentration (10
X
for Reaction Mix)
（稀释后样
本浓度）（对于反应预混液为
10X
）

，然后输入

6.6
。

3
）从单位下拉菜单中，选择

ng/
?
L
（默认）

。

4
）查看为样本稀释计算的剂量。

8
、实验材料订购

在
Materials List
（材料列表）屏幕上，查看建议用于准备
PCR
反应板的材
料列表。或者，您可从
Applied Biosystems Store
（
Applied Biosystems
产品仓库）
订购所建议的材料。

创建购物篮，向购物列表中添加项目，然后登录以提交您
的订单。

您必须具有不受限制的网络连接才能访问

Applied
Biosystems
Store
（
AppliedBiosystems
产品仓库）

。

1
）在
Applied Biosystems Store
（
Applied Biosystems
产品仓库）网站上查
找靶检测套件：

a.
确保您的计算机已连接到因特网。

b.
单击

Enter
Gene
Name
（输入基因名）字段，输入

RNase
P
，然后单击

FindAssay
（查找检测套件）

。

c.
在
Find Assay Results
（发现检测套件结果）对话框中，选择您的检测套
件。

d.
单击

Apply Assay Selection
（应用检测套件选择）

。

2
）完成
Experiment Materials List
（实验材料列表）窗格：

a.
从
Display
（显示）下拉菜单中，选择

All Items
（所有项）

（默认）

，然
后查看建议的材料。

若需要，使用右侧的滚动条查看所有项。

3
）用于进行定量实验的
Inventoried/Made
to
Order
检测设计用于配合以下

TaqMan?
母液使用：

TaqMan?
Fast
Universal
PCR
Master
Mix
(2
?
),
No
AmpErase?
UNG
，

250
次反应，编号

TaqMan? 2
?
Universal PCR Master Mix
，
200
次反应，编号

TaqMan? 2
?
Universal PCR Master Mix
，
2000
次反应，编号

10
包装
TaqMan? 2
?
Universal PCR Master Mix
，编号

TaqMan? 2
?
Universal PCR Master Mix, No AmpErase? UNG
，
200
次反应，
编号

TaqMan?
2
?

Universal
PCR
Master
Mix,
No
AmpErase?
UNG
，

2000
次反应，编号

10
包
装

TaqMan?
2
?

Universal
PCR
Master
Mix
，

No
AmpErase?
UNG
，编号

4
）靶
DNA
或
cDNA
有几种
TaqMan
和
SYBR Green
试剂可用于定量实验。

?
试剂

TaqMan?
Fast
Universal
PCR
Master
Mix
(2
?
),
No
AmpErase? UNG
，
250
次反应

TaqMan? 2
?
Universal PCR Master Mix
，
200
次反应，编号

TaqMan? 2
?
Universal PCR Master Mix
，
2000
次反应，编号

10
包装
TaqMan? 2
?
Universal PCR Master Mix
，编号

TaqMan? 2
?
Universal PCR Master Mix, No
，
AmpErase? UNG
，
200
次反应，
编号

TaqMan? 2
?
Universal PCR Master Mix, NoAmpErase? UNG
，
2000
次反应，
编号

10
包装

TaqMan?
2
?

Universal
PCR
Master
Mix
，
No
AmpErase?
UNG
，

编号

TaqMan? PCR Core Reagents Kit
，
200
次反应，编号
N808-0228
? Green
试剂

Power
SYBR? Green PCR Master Mix (1 mL)
，
40
次反应，编号

Power
SYBR? Green PCR Master Mix (5-mL)
，
200
次反应，编号

Power
SYBR? Green PCR Master Mix(10 ×
5-mL)
，
2000
次反应，编号

Power
SYBR? Green PCR Master Mix (50 mL)
，
2000
次反应，编号

SYBR? Green PCR Master Mix (1-mL)
，
40
次反应，编号

SYBR? Green PCR Master Mix (5-mL)
，
200
次反应，编号

SYBR? Green PCR Master Mix (50-mL)
，
2000
次反应，编号

SYBR? Green PCR Core Reagents
，
200
次反应，编号

9
、完成设计向导



要完成
Design Wizard
（设计向导）工作流程，查看反应板布局，然后选择
一个退出选项。

1
）在

Review
Plate
for
Experiment
（查看实验的反应板）窗口中，查看反
应板布局。

2
）单击

Save Experiment
（保存实验）

。

3
）在
Save Experiment
（保存实验）对话框中，单击

Save
（保存）以接受
默认文件名和位置。

示例实验被保存并关闭，并且您返回到

Home
（主页）屏
幕。

二、准备反应工作

如何为标准曲线实验准备
PCR
反应。

1
、准备样本稀释

在将样本添加到最终反应预混液之前，执行样本稀释。采用
StepOneTM
软
件计算的剂量稀释样本。（样本稀释计算）

根据储液中的样品浓度？ng/?
L
，
Stepone
软件计算出稀释剂量。因为在

StepOne
软件中，样本量仅限于反应总量的

10%
，因此需要进行样本稀释。

反
应总量为每次反应
25 ?
L
，因此样本量为每次反应
2.5 ?
L
。根据

“
样本稀释计算
”
表稀释样本。

1
）所需材料


用于稀释样本的稀释液（
TE
缓冲液或水）、样本储液


微量离心管、移液枪、移液枪枪头、试管振荡器、离心机

2
）
为< br>每
份
拟
稀
释
样
本
标
记
一< br>个
单
独
的
微
量
离
心
管
：< br>Population
1
、

Population 2
等

3
）将所需剂量的稀释液添加到每个空反应管内。（
14.2 ?
L
）

4
）将所需剂量的样本储液添加到每个反应管内。（
1?
L
）

5
）振荡每份稀释的样本
3
至
5
秒，然后短暂地离心反应管。

6
）将稀释后样本置于冰上，直到准备好反应板。

2
、准备标准品稀释序列


采用

StepOne
软件计算的剂量准备标准品稀释序列。（反应预混液计算）
根据储液 中的标准品浓度？
copies/?
L
，
Stepone
软件计算出 剂量。

1
）所需材料

用于稀释标准品的稀释液（
TE
缓冲液或水）、标准品储液


微量离心管、移液枪、移液枪枪头、试管振荡器、离心机

2
）为每份标准品标记一个单独的微量离心管：
Std. 1
、
Std. 2
、
Std.3
、
Std. 4
、
Std. 5
。

3
）将所需剂量的稀释液添加到每个空反应管内：
Std.
1
（
14.5?
L
）、
Std.
2
（< br>9.1?
L
）、
Std.3
（
9.1?
L
） 、
Std. 4
（
9.1?
L
）、
Std. 5
（
9.1?
L
）。

4
）在
Std. 1
反应管中准备稀释液
1
：

a.
振荡储液
3
至
5
秒，然后短暂地离心反应管。

b.
使用新的移液枪枪头，将
3.6 ?
L
储液添加到
Std. 1
反应管中。

c.
振荡
Std. 1
反应管
3
至
5
秒，然后短暂地离心反应管。