广州植发价格-阿莫西林颗粒说明书
DNA
定点突变实验具体步骤及详细说明
定点突变是指通过聚合 酶链式反应(
PCR
)等方法向目的
DNA
片段(可
以是基因组,也 可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)
,
包括碱基的添加、删除、点突变 等。
一、引物设计
每条引物都要携带有所需的突变位点,引物一般长
25~45 bp
,设计的突变位
点需位于引物中部。
二、反应
1.
使用高保真的
pyrobest DNA
聚合酶,循环次数少,一般为
12
个循环。
2.
反应体系:
(
1
)
10x pyrobest Buffer
:
5 ul
(
2
)
dNTP Mixture(10 mM)
:
1 ul
(
3
)模板
DNA(5~50 ng)
:
1ul
(
4
)
primer 1 (125 ng)
:
1 ul
(
5
)
primer 2 (125 ng)
:
1 ul
(
6
)
pyrobest DNA polymerase
(
TaKaRa
)
(5 U/ul)
:
0.25 ul
(
7
)加无菌蒸馏水至
50ul.
三、产物沉淀纯化
1.
加
1/10 体积的醋酸钠,
1
倍体积的异丙醇,混匀置冰上(或
-20
℃冰箱)5min
,离心弃上清。
2.
70~75%
乙醇洗盐两次,烘干后溶于无菌水中(此步可省略,直接用
DpnI
酶切)。
四、
DpnI
酶切
1.
酶切体系
(
1
)
Buffer
:
2 ul
(
2
)
BSA
(
100x
):
0.2 ul
(
3
)
DNA
:
x ul
(
4
)
DpnI
:
0.5 ul
(
5
)加无菌去离子水至
20 ul
。
2.
30
℃酶切
1~4 h
。
3.
65
℃水浴
15min
终止反应。
五、转化
将酶切产物转化大肠杆菌
DH5a
菌株,利用抗生素筛选突变子。
六、测序验证
注意事项
1.
引物和质粒都 准备好后,当然就是做
PCR
喽,不过对于
PCR
的酶和
buffe r
,不能用平时的,我们做
PCR
把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个
K< br>,所以要用那些
GC buffer
或扩增长片段的
buffer
,另 外,要用保真性能较
好的
PFU
酶来扩增,防止引进新的突变。
2.
Quick change
试剂盒分为几种不同的类型 ,QuikChange?、
Site-
Directed Mutagenesis Kit
标准点突变试剂盒
、QuikChange?、
XL Site-
Directed Mutagenesis Kit
长模板单点突变试剂盒(>8kb
)从原理上是一样
的,只是
PCR
的酶和
BUFFER
不一样,后面用了比较适合长片段扩增的酶和
BUFFER
罢了,没什么特别的东西。
3.
DpnI
处理的时间最好长一点,最少一个小时吧, 最好能有两三个小时,因
为如果模板处理得不干净,哪怕只有那么一点点,模板直接在平板上长出来,< br>就会导致实验失败。
4.
实验板长出来的菌有两种 可能,一种是质粒
DPNI
没处理干净长出来的(模
板),一种是
PCR产物转化出来的(突变体),不过这两种菌长得一模一样,
即使提出质粒来也是一样(酶切和
PCR
都无法区分),除了测序,是分不出来
的。
5.
做
PCR
时也最好做一个负对照(不加引物),实验管由于
PCR
时有引物,
所以在
DNPI
处理前里面既含有模板又含有
PCR产物,而对照管由于
PCR
时
没放引物,所以在
DPNI
处理前 里面只有模板。如果两者都拿去
DNPI
处理,
就能够证明模板已经被去除干净。若实 验顺利的话应该是:正对照长菌负对照
不长菌。如果出现正负对照都长菌,那么就是
DpnI< br>没处理好,如果正负对照
都不长菌,那么有两种可能,一种是
PCR
阴性,也就 是说
PCR
出问题了,另
外一个可能就是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题,跑胶说 明不了问题,那
就做个转化的对照,拿试剂盒的对照实验去试感受态,马上就能知道转化有没
问题。
经验
一、经验分享
1.
实验的 目的应该比较明确吧:就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另
外一个碱基。一般情况下我们会有几种 可能使我们需要这样去做:
第一:我们吊出来的基因有点突变,相信这可能是大 家经常会遇到的问题。基
因好不容易吊出来,并装进了自己的载体,却发现有一两个碱基跟自己的预期< br>序列或所有的公共数据库不匹配,然后暴昏。
大家实验室里面还是用Taq
酶为主吧,
Pfu
这样的高保真酶大家应该用得不多
吧,
Taq
酶的优点和缺点都很明显:优点就是扩增效能强,缺点就是保真性
差,其错配机率是比较 高的,相关数字忘了,大家可以去网上查那个数字,不
过感觉如果是
2000bp
的基 因,如果扩四五十个循环的话,很大机率会出现点
突变,当然这也跟具体
PCR
体系里 的
Buffer
有很大关系,详细情况这里就不
讨论了。
第二:要研究基因的功能,在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列,或者
改造成不同的亚型,总 之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要,相信
这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。
广州植发价格-阿莫西林颗粒说明书
广州植发价格-阿莫西林颗粒说明书
广州植发价格-阿莫西林颗粒说明书
广州植发价格-阿莫西林颗粒说明书
广州植发价格-阿莫西林颗粒说明书
广州植发价格-阿莫西林颗粒说明书
广州植发价格-阿莫西林颗粒说明书
广州植发价格-阿莫西林颗粒说明书
本文更新与2021-02-02 17:57,由作者提供,不代表本网站立场,转载请注明出处:http://www.xapfxb.com/yuer/442493.html