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金华男科医院DNA定点突变实验具体步骤及详细说明

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-02-02 17:57

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2021年2月2日发(作者:如何根治脚臭)

DNA
定点突变实验具体步骤及详细说明

定点突变是指通过聚合 酶链式反应(
PCR
)等方法向目的
DNA
片段(可
以是基因组,也 可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)

包括碱基的添加、删除、点突变 等。

一、引物设计


每条引物都要携带有所需的突变位点,引物一般长
25~45 bp
,设计的突变位
点需位于引物中部。


二、反应


1.

使用高保真的
pyrobest DNA
聚合酶,循环次数少,一般为
12
个循环。


2.

反应体系:



1

10x pyrobest Buffer


5 ul


2

dNTP Mixture(10 mM)

1 ul


3
)模板
DNA(5~50 ng)

1ul


4

primer 1 (125 ng)

1 ul




5

primer 2 (125 ng)

1 ul


6

pyrobest DNA polymerase

TaKaRa

(5 U/ul)

0.25 ul


7
)加无菌蒸馏水至
50ul.

三、产物沉淀纯化


1.


1/10 体积的醋酸钠,
1
倍体积的异丙醇,混匀置冰上(或
-20
℃冰箱)5min
,离心弃上清。


2.
70~75%
乙醇洗盐两次,烘干后溶于无菌水中(此步可省略,直接用

DpnI
酶切)。


四、
DpnI
酶切


1.

酶切体系



1

Buffer

2 ul


2

BSA

100x
):
0.2 ul




3

DNA

x ul


4

DpnI

0.5 ul


5
)加无菌去离子水至

20 ul



2.
30
℃酶切

1~4 h



3.
65
℃水浴
15min
终止反应。


五、转化


将酶切产物转化大肠杆菌
DH5a
菌株,利用抗生素筛选突变子。


六、测序验证

注意事项

1.

引物和质粒都 准备好后,当然就是做
PCR
喽,不过对于
PCR
的酶和
buffe r
,不能用平时的,我们做
PCR
把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个
K< br>,所以要用那些
GC buffer
或扩增长片段的
buffer
,另 外,要用保真性能较
好的
PFU
酶来扩增,防止引进新的突变。




2.
Quick change
试剂盒分为几种不同的类型 ,QuikChange?、
Site-
Directed Mutagenesis Kit
标准点突变试剂盒

、QuikChange?、

XL Site-
Directed Mutagenesis Kit
长模板单点突变试剂盒(>8kb
)从原理上是一样
的,只是
PCR
的酶和
BUFFER
不一样,后面用了比较适合长片段扩增的酶和
BUFFER
罢了,没什么特别的东西。


3.
DpnI
处理的时间最好长一点,最少一个小时吧, 最好能有两三个小时,因
为如果模板处理得不干净,哪怕只有那么一点点,模板直接在平板上长出来,< br>就会导致实验失败。


4.

实验板长出来的菌有两种 可能,一种是质粒
DPNI
没处理干净长出来的(模
板),一种是
PCR产物转化出来的(突变体),不过这两种菌长得一模一样,
即使提出质粒来也是一样(酶切和
PCR
都无法区分),除了测序,是分不出来
的。


5.


PCR
时也最好做一个负对照(不加引物),实验管由于
PCR
时有引物,
所以在
DNPI
处理前里面既含有模板又含有
PCR产物,而对照管由于
PCR

没放引物,所以在
DPNI
处理前 里面只有模板。如果两者都拿去
DNPI
处理,
就能够证明模板已经被去除干净。若实 验顺利的话应该是:正对照长菌负对照
不长菌。如果出现正负对照都长菌,那么就是
DpnI< br>没处理好,如果正负对照
都不长菌,那么有两种可能,一种是
PCR
阴性,也就 是说
PCR
出问题了,另
外一个可能就是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题,跑胶说 明不了问题,那


就做个转化的对照,拿试剂盒的对照实验去试感受态,马上就能知道转化有没
问题。

经验

一、经验分享


1.

实验的 目的应该比较明确吧:就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另
外一个碱基。一般情况下我们会有几种 可能使我们需要这样去做:


第一:我们吊出来的基因有点突变,相信这可能是大 家经常会遇到的问题。基
因好不容易吊出来,并装进了自己的载体,却发现有一两个碱基跟自己的预期< br>序列或所有的公共数据库不匹配,然后暴昏。


大家实验室里面还是用Taq
酶为主吧,
Pfu
这样的高保真酶大家应该用得不多
吧,
Taq
酶的优点和缺点都很明显:优点就是扩增效能强,缺点就是保真性
差,其错配机率是比较 高的,相关数字忘了,大家可以去网上查那个数字,不
过感觉如果是
2000bp
的基 因,如果扩四五十个循环的话,很大机率会出现点
突变,当然这也跟具体
PCR
体系里 的
Buffer
有很大关系,详细情况这里就不
讨论了。

第二:要研究基因的功能,在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列,或者
改造成不同的亚型,总 之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要,相信
这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。

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