合肥人流医院质粒DNA及λDNA的酶切 分子生物学实验

2021年2月2日发(作者：牙神经痛吃什么药)
质粒
DNA
及
λ
DNA
的酶切、连接、转化及重组子的筛选 、鉴定





一、实验目的


1
、学习和掌握限制性内切酶的特性


2
、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法

3
、掌握利用
CaCl2
制备感受态细胞的方法


4
、学习和掌握热击法转化

的原理和方法


5
、掌握
α
互补筛选法的原理


6
、学习用试剂盒提取重组质粒
DNA
的方法


7
、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法


二、实验原理
:
外源
DNA
与载体分子的连接即为
DNA
重组技术，这样重新组合的
DNA
分子叫做重
组子。重组的
DNA
分子式在
DNA连接酶的作用下，有
Mg2+
、
A
TP
存在的连接缓冲系统中，
将分别经限制性内切酶酶切酶切酶切酶切的载体分子和外源
DNA
分子连接连 接连接连
接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中导入感受态细胞中导入感受态细胞中导入感受态 细胞
中，
将转化后的细胞在选择性培养基选择性培养基选择性培养基选择性培养基中培养，可以
通过
α
α
α
α
互补筛选法互补筛选法互补筛选法互 补筛选法筛选出重组子，
并可通过酶切酶
切酶切酶切电泳电泳电泳电泳及
PCRPCR PCRPCR
检验检验检验检验的方法进行重组子的
鉴定。


1.

重组子的构建


酶切时首先要了解目的基因的酶切 图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专
一的识别位点，
否则当用一种或两种限制性内 切酶切割外源工体
DNA
时不能得到完整的目
的基因。
其次要选择具有相应的 单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有
双酶切法和单酶切法两种。本实验采 用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的
DNA
片段，
酶切后的片段两端将产生 相同的黏性末端或平末端，
再选用同样的限制性内切酶处理
载体。在构建重组子时，除了形成正 常的重组子外，还可能出现目的
DNA
片段以相反方向
插入载体分子中，或目的
DNA
串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环
化的现象。
单酶切 法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。
各种限制性内切酶都有去最佳反
应条件，
最主 要的因素是反应温度和缓冲液的组成，
在双酶切体系中，
限制性内切酶在使用
时应遵循 “先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。

（要达到高效率的连接，必须酶切完全， 酶切的
DNA
数量要适当。另外，酶切反应
的规模也取决于需要酶切的
DNA
的量，以及相应的所需酶的量。可以适当增加酶的用量，
但是最高不能超过反应总体积的
10%
，因为限制性核酸内切酶一般是保存在
50%
甘油的缓
冲液中，如果 酶切反应体系中甘油的含量超过
5%
，就会抑制酶的活性。
）

连接 反应总是紧跟酶切反应，
外源
DNA
片段与载体分子连接的方法即
DNA分子体外
重组技术主要依赖限制性核算内切酶和
DNA
连接酶催化完成的。
DNA
连接酶催化两双链
DNA
片段相邻的
5
’
-
磷酸和
3
’
-OH
间形成磷酸二酯键。
在分子克隆中最有用的DNA
连接
酶是来自
T4
噬菌体的
T4 DNA
连接酶 ，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体
DNA
和外源
DNA
的摩 尔数之比控制在
1:
（
1~3
）之间，可以有效地解决
DNA
多拷贝插入
的现象。反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是
16
℃， 用常用的连接时间
为
12-16h
。

2.

感受态细胞的制备及质粒转化


构建好的重组
DNA
转入 感受态细胞中进行表达的现象就是转化。
能进行转化的受体细
胞必须是感受态细胞，即受体细胞 最容易接受外源
DNA
片段实现转化的生理状态，它决定
于受体菌的遗传特性，
同时与菌龄、
外界环境等因素有关。
人工转化是通过人为诱导的方法
使细胞具有摄取
DNA
的能力，或人为地将
DNA
导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控< br>制无关，常用热击法，电穿孔法等。能否实现质粒
DNA
的转化还与受体细胞的遗传特性 有
关，
所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，
即不含限制性内切酶和甲基 化酶的
突变株。


目前常用的感受态细胞制备方法有
CaCl2< br>法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为
15%
的无菌甘油，
-70
℃可保存半年至一年。经过
CaCl2
处理的细胞细胞膜通透性增加，允
许外源
DNA
分子进入。在低温下，将携带有外源
DNA
片段的载体与感受态细胞混合，经
过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。进入受体细胞的外源
DNA
分子通过复制 、表
达，
使受体细胞出现新的遗传性状。
将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，
即可筛选
出重组子。本实验以

DH
5
α
菌株为 受体细胞，用
CaCl2
处理，使其处于感受态，然
后将重组后的
PUC19
质粒在
42
℃下热击
90s
，实现转化。

3.

重组子的筛选鉴定


重组
DNA
转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组
DNA
分子，一般仅
有少数重组
DNA
分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组
DNA
分
子之后能良好增殖。
并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。
再者 ，
在这
些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组
DNA
分子外， 另外一些还可能是由
于载体自身或一个载体与多个外源
DNA
片段形成非期待重组DNA
分子导入所致。因此必
须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，
并从转化的细胞群体中分理出带有目的
基因的重组子。本实验中采用的方法是平板筛选法电泳筛选法及< br>PCR
检测方法。

抗药性筛选主要用于重组质粒
DNA
分子 的转化子的筛选，而不含重组质粒
DNA
分子
的受体菌则不能存活，
α
互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子。质粒
PUC19
携带有氨苄青霉素抗 性基因（
Ampr
）
,
在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导
入质粒
PUC19
的受体细胞，
在含有氨苄青霉素的平板上不生长。
质粒PUC19
进入
DH
5
α
后，通过
α
-< br>互补作用，形成完整的
β
-
半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用
β
-
半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，
pH
降低， 培养集中的指示剂变红，转化
子的菌落变红。不含质粒的
DH 5
α
，没有
β
-
半乳糖苷酶活性，不能利用培养集中的
乳糖产生有机酸，而是利用培养集 中的有机碳源，不使培养基
pH
降低，在不含有氨苄青霉
素的麦康凯培养基上形成白色 菌落。
重组后的载体
DNA
因为目的基因的插入位点在
PUC19
乳 糖利用基因内部，不能形成
α
-
互补作用，所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸 ，
在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。

挑选在氨苄青霉素培养基上生 长的白色菌落，
通过扩增培养。
因为许多菌落存在假阳性
情况，在氨苄青霉素培养基上 的白色菌落可能是导入的重组载体
DNA
菌落，也可能是载体
自连后发生突变的菌落， 所以还要鉴定转化子中重组质粒
DNA
分子的大小，可将重组的载
体
DNA< br>提取出来，进行后续的酶切、电泳检验。

也以提取的重组质粒为模板，利用现有的引物 ，进行那个
PCR
扩增，检测个噢偶见的
质粒是否是所期望的重组质粒。

4.

PCR
技术


PCR
（
Polymerase chain reaction
）即聚合酶 链式反应，其原理类似于
DNA
的体内复制，
又叫做“体外基因扩增”
。反应 体系包括：模板
DNA
、寡核苷酸引物、
Mg2+
，
4
种脱 氧核
糖核酸（
dNTP
）
、
DNA
聚合酶和合适的缓冲体系 。反应基本程序包括
DNA
变性、引物复性
及引物延伸三个基本过程。
这三个 反应构成一个循环，
反复进行。
每一轮循环扩增的产物可
作为下一轮扩增反应的模板。 理论上每一轮循环可使
DNA
数量增加一倍，反复
30
次，特
异DNA
序列片段以指数方式可扩增
105~106
。通过此技术可以使非常微量的
DNA
产生大
量的
PCR
产物，因此这个技术是一项在体外大量生产 目的基因的技术。


现在普遍通用的是一种从水生嗜热杆菌中提取的
Taq
DNA
聚合酶，而且大大提高了扩
增片段的特异性、
灵敏性和扩增效率。反应中用的引物有两段，
一条称为上游引物或者正向
引物，一条称为下游引物或者反向引物 。引物的设计十分重要，在设计时应遵循以下原则：
长度一般为
18
到
24< br>个碱基；
G+C
的百分含量在
40%~60%
；单条引物内部避免含有 二级结
构，避免形成引物二聚体；最好以
1
到
2
个
G
或
C
碱基开始或结束；引物的
5
’端可以被
修饰，但是
3
’端绝对不能进行任何修饰，而且引物的
3
’端要避开密码子的第三位。模板
的浓度不能太大，
dNTP
的浓度为
2.5mmol/L
，金属离子的浓度为
1.5mmol/L
，缓冲液为
pH
为
7.2~8.0
的< br>Tris
—
HCl
溶液。


二、实验材料：






1.
菌株：
DH 5
α


2.
培养基：

LB
培养基、麦康凯培养基（加入氨苄青霉素）


3.
试剂材料：

酶切反应：
（
DNA
PUC19
质粒，酶切
10
×
buffer
，
Hind
Ⅲ
,
重蒸水，
λ

DNA
。
）


连接反应：
（酶切后的
DNA
PUC19
质粒和
λ

DNA
，
连接
10
×
buffer
，
T4
连接酶，
重蒸水。
）

感受态细胞的制备：
（
0.1M CaCl2
）

转化：
（连接液和感受态细胞，
0.1M CaCl2
，冰块。
）


重组菌的挑选、检验：
试剂盒（含有
Rnase A
的溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，
HB buffer,DNA

washing buffer
，
elution

buffer
）
,
酶切后的
DNA
PUC19
质粒，试剂盒抽提的
DNA
，酶切
10
×
buffer
，< br>Hind
Ⅲ
,
重蒸水，琼脂糖，
TAE
缓冲液。上样缓冲液，
EB
染液。


PCR
检测

：

10
×
PCR buffer,dNTP
,
模板，引物
1< br>，引物
2
，水，
Taq DNA
聚合酶，琼脂糖，
TAE
、溴化乙锭（
EB
）


4.
仪器器材：

20
、
200
、
1000ul
的枪和枪尖，
1.5 ml
的
Ep
管，
恒温培养箱，
水浴锅，
平板，
三角瓶，试管，接种环，牙签，酒精灯，火柴，冰箱，离心机，电泳槽，紫外 仪，
PCR
扩
增仪


三、实验步骤

载 体与外源片段的酶切→连接→感受态细胞的制备→质粒转化与重
组子的筛选→重组子的挑取与复证→重组 质粒的提取与电泳检测→
PCR
检测

（一）酶切

1< br>、在两支
Eppendorf
管中依次加入酶切反应的各种成分，混匀，适当离心，使样 品
集中于管底；酶切反应各成分添加如下：

表
1 pUC19
质粒及
λ
DNA
酶切反应体系


目的
DNA
（
λ
DNA
）

试剂

λ
DNA
Buffer
ddH2O
体积
/ul
4.0
1.5
8.5
载体
DNA
（
pUC19
质粒）

试剂

pUC19
质粒

Buffer
ddH2O
体积
/ul
5.0
3.0
20.0
Hind
Ⅲ核酸内切酶
1.0
Hind
Ⅲ核酸内切酶
2.0
加样次序：
ddH2O
、
Buf
、
DNA
、酶

2
、在
37
℃恒温水浴锅中反应
1h
以上。
3.
分别取上述酶切样品
2~5uL
，与
1~2uL
电泳上样缓 冲液混合均匀，进行琼脂糖凝
胶电泳，观察酶切反应是否彻底，剩余样品可以继续酶切。
4.
待电泳观察酶切反应完全后，将剩余样品从恒温水浴锅中取出，置
65
℃恒温 水浴
锅中保存
10~15min
，终止酶切反应

5.
样品可以直接进行酶切反应或者保存于
-20
℃冰箱备用

（二）连接

1
、在
Eppendorf
管中依次加入连 接反应的各种成分，混匀，适当离心，使样品集中
于管底；连接反应各成分添加如下：

表
2
连接反应体系

试剂

λ
DNA/Hind
Ⅲ

pUC19DNA/Hind
Ⅲ

10*Ligase Buffer
ddH2O
T4-DNA
连接酶

体积
/ul
2.0
2.0
1.0
4.0
1.0
< br>2
、在
16
℃的恒温水浴锅中反应
12-16h
或者过夜；< br>
3
、连接产物可用于转化实验。

（三）感受态细胞的制备

1
、用接种环从含有
DH5
α
的培养基平板上挑取少量灰白色

菌落接种到

20ml LB
培养基里，
37
℃振荡培养过夜。实验均在无菌条件下，以防污染；

2
、取
37
℃过夜培养物，此时的培养物较浑浊，颜色变深。按
1%
的接种量吸取
200
μ
l
转接到
20ml LB
培养基中，
37
℃振荡培养
2.5~3
小时；

3.
分别取
1.5ml
菌液于
2
个无菌的
1.5ml E ppendorf
管中，
5000rpm
离心
5min
，弃上清液，吸干；重复收集菌体一次，使菌量增多；每支离心管中加入用冰预冷的
1ml
0.1mol/l
CaCl
2
，
漩涡震荡使细胞悬浮混匀，
冰上放置
15min
，
4
℃
5000rpm
离心
5min
；

4
、弃上清液，吸干后，加入
100ul CaCl
2
悬浮冰浴至使 用；上述方法制好的感受态
细胞置于冰上，
48h
之内均可用于转化，分装成
2x50ul
和
100ul
三管。

（四）转化实验

1
、取制备好并摇匀后的
3
管感受态细胞悬液，分别作如下处理：

（
1
）感受态细胞悬液
50uL+pUC19
质粒
DNA1 uL
（
2
）感受态细胞悬液
50uL+DH5a
（
3
）感受态细胞悬液
100uL+
连接产物
5uL 2
、将以上各样品管轻轻摇匀，冰浴
10min
，在
42
℃水浴 中热击
90s
，然后迅速置于冰
上
2~3min
，质粒已经吸附到感 受态细胞的表面，此时不能剧烈振荡，以增加转化效
率；