白发症质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤

2021年2月2日发(作者：男人举不起来)
质粒
DNA
的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤


【原理】


转化是将外源

DNA
分子导入到 受体细胞，
使之获得新的遗传特性的一种方法。
转化所用的
受体细胞一般是限制

-
修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（

R-
，

M-
）
。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后 ，细胞膜、的通透性发生暂时
性改变，成为能允许外源

DNA
分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的

DNA
分子通过复
制和 表达实现信息的转移，
使受体细胞具有了新的遗传性状。
将经过转化的细胞在筛选培养
基上培养，即可筛选出转化子（带有异源

DNA
分子的细胞）
。


本实验采用

CaCl2
法制备感受态细胞。其原理是细胞处于

0
～
4
℃，

CaCl2
低渗溶液中，
大肠杆菌细胞膨胀成球状。
转化混合物中的

DNA
形成抗

DNA
酶的羟基

-
钙磷酸复合物粘
附于细胞表面，经

42
℃

90
秒热激处理，促进细胞吸收

DNA
得合物。将细菌放置在 非选
择性培养基中保温一段时间，
促使在转化过程中获得的新的表型，
如氨苄青霉素耐 药
（

Amp
r
）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含

Amp
的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可
获得细菌菌落。


本实验是将人

Bcl-2
重组质粒转化

DH5
α
扩增菌，转化后在含

Amp
的培养基上进行筛
选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。


含人

Bcl-2
重组质粒的

DH5
α
菌用于质粒

DNA
的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶
的酶切底物

DNA
。


【试剂与器材】


1
．

LB
液体培养基

10g
胰蛋白胨、

5g
酵母提取物、

10gNaCl
加水至

1L
，高压灭菌消
毒。


2
．

LB
固体培养基

LB
液体培养基中加

1.5%
琼脂粉，
高压灭菌消毒，
待泠却至不烫手背
时铺培养皿。


3
．

0.1mol/L CaCl2
高压灭菌消毒或过滤除菌。


4
．氨苄青霉素

用无菌水或生理盐水配制成

100mg/ml
溶液，置

-20
℃保存。


5
．人

Bcl-2
重组质粒

它是

Eco
R
Ⅰ单酶切的

pBluescript
Ⅱ

KS(-)
载体与

EcoR
Ⅰ单酶
切的人

Bcl-2 cDNA
重组而成的，大小为

4 861bp
，前者是一种由

pUC19
质粒衍生而来的
具有

2
961bp
的质粒载体。因此用

Eco
R
Ⅰ酶切则应到空载

pBluescript
Ⅱ

KS(-)
载体

(2.96kb)
和人

Bcl-2 cDNA
片段

(1.9kb)
。配制成

2g/1
μ

l
。


6
．大肠杆菌

DH5
α

此为

DNA
扩增菌


7
．恒温水浴箱