生殖系统结构图质粒DNA提取实验

2021年2月2日发(作者：女用性药)

质粒
DNA
提取实验


质粒
DNA< br>提取可以：（
1
）快速纯化质粒；（
2
）用于测序、体外转录与翻译、 限制性内切
酶消化、细菌转化等分子生物学实验。


质粒多为一些双链、环 状的
DNA
分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性
遗传单位。
质粒是进行分子生物学实验操作，
进行遗传工程改良物种等工作时最主要的
DNA
载 体。


提取质粒的基本步骤分为三步：

①细菌的培养和质粒的扩增

②细菌菌体的裂解

③质粒
DNA
的纯化


一、材料与试剂准备


1.

材料：大肠杆菌。

2.

仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，
冷冻真空干燥机 ，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪。

3.

试剂：

（
1
）
Solution I
：
25 mM Tris- Hcl(pH7.4)
，
10 mM EDTA(pH8.0)
，
50 mM
葡萄糖，
高压灭菌，
4
℃
保存。

（
2
）
Solution II
：
0.2 M NaOH
，

1%SDS
现配现用。

（
3
）
Solution III
：
5 N KAc pH4.8
，高压灭菌，
4
℃保存。

（
4
）
3 M NaAc pH5.2
，高压灭菌，
4
℃保存。

（
5
）异丙醇，溶菌酶（
8 mg/ml
），酚
/
氯仿，无水乙醇，
70%
乙醇，
LB
培养基，电泳试剂。


二、实验步骤


1.
摇菌培养

1
）将鉴定测序正确的克隆菌液涂在
LB
固体平板。

2< br>）置于
37
℃恒温培养箱，培养
12-17h
，待长出菌落。

3
）

灭菌
15ml
离心管内加入
5ml
含抗生素的
LB
液体培养基，编号标记。

4
）

挑取单克隆菌团放置液体培养基，每个培养基放置
1
个菌落。

5
）

37
℃，
180rpm
，振荡培养过夜。


2.
收获细菌并裂解

1
）

离心扩增好的菌液，按说明书将菌液重悬，转入
1.5ml
离心管中。

2
）用质粒小量抽提试剂盒，按说明书要求提取质粒。

3
）

细菌高速离心
1min,
彻底去除上清。

4
）加入
250ulRB
溶液，振荡器充分悬浮细菌。

5
）加入
250ulLB
溶液。立即上下颠倒
10
次，使细菌裂解，室 温，放置
2min
。

6
）加入
250ulNB
溶 液。立即上下颠倒
10
次，使之充分中和，室温，放置
2min
。

正德




利用




厚生




惟和