北京华山医院质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

2021年2月2日发(作者：6大症状是更年期前兆)
实验序号


实验时间


一．实验预习

1
．实验目的：

实验名称

质粒
DNA
的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳

是否小组合作

是（√）

否（


）

（
1
）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；

（
2
）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测
DNA
的方法和技术；


2
．实验原理：

1
）质粒
DNA
的提取：

（
1
）关于质粒：

质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外（ 细胞质中）呈游离状态的双链、
闭环的
DNA
分子。
质粒通常携带有染色体上 所不存在的能够表达产生抗生素、
耐
受重金属等重要性状的基因。
细菌质粒的大小范围 从
1kb
至
200kb
以上不等，
且
拥有自己的复制起始位 点，
可不依赖于染色体而进行独立自主复制。
一些小的质
粒利用宿主细胞的酶进行复制 ，而较大的质粒则自身携有复制与编码的有关酶。

（
2
）一般分离质粒DNA
的方法都包括
3
个步骤：

①培养细菌，使质粒
DNA
大量扩增；

②收集和裂解细菌；

③分离和纯化质粒
DNA
。

分离制备质粒
DNA
的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、
SDS法、
羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、
质粒分子大小、
碱基组成和结构等特点以及质粒
DNA
的用途进行选择。

（
3
）碱裂解法提取大肠杆菌质粒
DNA
的原理：

碱裂解法提取质粒
DNA
是根据共价闭合环状质粒
DNA
和线性染色体DNA
在拓扑学
上的差异来分离质粒
DNA
。

在pH
值介于
12.0~12.5
这个狭窄的范围内，
线性的
DN A
双螺旋结构解开而变性，
尽管在这样的条件下，
共价闭环质粒
DNA
的氢键会被断裂，
但两条互补链彼此相
互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入
pH 4.8
乙酸钾高盐缓冲液恢复
pH
至中
性时，
共价闭合环状的质粒< br>DNA
的两条互补链仍保持在一起，
因此复性迅速而准
确；
而线性的染 色体
DNA
的两条互补链彼此已完全分开，
因复性较缓慢且不准确
而相互缠绕 形成不溶性网状结构。
而复性的质粒
DNA
恢复原来构型，
保持可溶性
状态。
通过离心，
染色体
DNA
与不稳定的大分子
RNA
，
蛋白质
-SDS
复合物等一起
沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿可以抽提纯 化上清液中的质粒
DNA
。


2
）质粒
DNA
的琼脂糖凝胶电泳：

（
1
）关于电泳技术：

电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分个构象有所不同的生物
大分子——尤其是蛋白质和核酸。
正因为如此，
电泳已成为生物化学和分子生物
学中应用最为广泛的技术之一，
其中在分子生物学实验中最为 常用的是琼脂糖凝
胶电泳。

琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分 辨率却相对较低。
通过改变琼脂糖凝胶的浓度，
应用标准的电泳技术可以分离
200< br>到
50,000
bp
大
小的
DNA
片断。< br>一般琼脂糖胶浓度在
0.5
％到
4
％之间，
且琼脂糖凝胶浓度 越大，
凝胶就越硬。
较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的
DNA
片断分离，而较低浓度的琼
脂糖胶则可以分离较大的
DNA
片断。

（
2
）琼脂糖凝胶电泳条带的观察：

通过观察示踪染料的迁移距离 可以判断
DNA
的迁移距离。
溴酚蓝染料在琼脂
糖凝胶的迁移速率大小与300
和
4000bp
大小的双链
DNA
片断相同。当迁移足够
距离后，就可以通过
Gelview
染色来观察
DNA
片断。
Gelview
是一种荧光染料。
它可以在做胶时混入其中在电泳时进行染色，
也可 以待电泳完成后将凝胶浸泡在
稀释的
Gelview
溶液中进行染色
。
但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝
胶中的
DNA
或
R NA
进行观察。

（
3
）质粒
DNA
的琼脂糖凝胶电泳分离：

DN A
分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，
DNA
分子在高于
等 电点的
pH
溶液环境中带负电荷，在电场中向正极移动，由于磷酸骨架在结构
上的重复 性质，
相同数量的双链
DNA
几乎具有等量的净电荷，
因此它们能以相同的速度向正极移动。
在一定的电场强度下，
DNA
分子的迁移速度取决于分子筛效
应，
即
DNA
分子本身的构型和大小。
具有不同分子质量或者不同构 型的
DNA
分子
泳动速率不一样，可以进行分离。

未切割的质粒< br>DNA
在其泳道上也许会出现几个条带，
之所以这样是由于质粒
DNA
在琼脂糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定的。
质粒
DNA
以下 列三种主要构象中的任何一种形式存在：

①

超螺旋
DNA
：

尽管质粒通常以开环的形式进行描述，
然 而在细菌细胞内
DNA
链即是盘绕在
组蛋白周围形成一种致密的结构。
这就是 所谓超螺旋结构，
由于其结构致密，
它
在凝胶中的泳动速度最快。

②

线性
DNA
：

当
DNA
损 伤在
DNA
双链相对应的两条链上同时产生切口时，
就会出现线性质
粒
DNA
，这种
DNA
的泳动速率介于超螺旋与切口质粒
DNA
之间 。

③开环
DNA
：

在质粒
DNA
复制 过程中，
拓扑异构酶
I
会在
DNA
双螺旋中的一条链中引入一
个切口，
解开质粒的超螺旋。
在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同
样也 会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。
这种形式的质粒迁移
速率最慢，其“松散 ”的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运动。


3
．

实验器材：

（
1
）实验仪器（
apparatus
）
：


恒
温
培
养
箱
（
Constant
temperature
incubator
）
、
恒
温< br>摇
床
（
Constant
temperature shaking
table
）
、高速离心机（
High
speed centrifuge
）
、漩涡振
荡器（
Vortex mixer
）
、超净工作台（
Bechtop
）
、高压灭菌锅（
Autocla ve
）
、微
量加样器（
Pipettes
）
、烧杯（
beaker
）
、量筒

（
graduated
cylinder
）
、

玻璃
棒
（
stir
bar
）
、

微波炉
（
microwave
）
、

天平
（
Pan
balance
）
、
电泳梳子
（
comb
）
、
电泳槽

（
electrophoresis
tank
）
、

电泳器

（
Electro-phoresis System
）
、

紫
外灯（
Ultraviolet transilluminator
）



3
）
、材料与试剂（
Reagents
）
：

①溶液
I
（
Solution
Ⅰ）
：

50mmol/L
葡萄糖；
25mmol/L
三羟基甲基氨基甲烷（
Tris
）
Tris- HCl
（
pH8.0
）
；
10mmol/L
乙二胺四乙酸（
EDTA
）
pH8.0
溶液
I
可成批配制，每瓶约
100ml
，
10
磅高压蒸气灭菌
15
分钟，贮存于
4
℃。


②溶液Ⅱ（
Solution
Ⅱ）
：新鲜配制，等体积混合

0.2mol/L NaOH
（临用前用
10mol/L
贮存液现用现稀释）
；
1% SDS
（可用
10
％
贮存液稀释配制）注意：
SDS
易产 生气泡，不要剧烈搅拌。


③溶液
III
（
Solution
Ⅲ，
100mL)
：加上后混匀会形成絮状沉淀

60mL 5mol/L KAc
，

11.5mL
冰醋酸，

28.5mL H
2
O
（该溶液钾离子浓度为
3mol/L，醋酸根离子浓度为
5mol/L
）


④
TE
液缓冲液：
10 mmol/L Tris- HCl
（
pH8.0
）
；
1 mmol/L EDTA
（
pH8.0
）

⑤
70%
乙醇；

⑥平衡酚：氯仿
1
：
1
：

将量取
25 ml Tris- HCl
（
pH8.0
）平衡苯酚，加入
24 ml
氯仿和
1 ml
异戊
醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，
4
℃保存。

⑦
LB
培养基：

胰化蛋白胨
10g
酵母提取物
5g
NaCl 15g
pH 7.0
⑧琼脂糖（
Agarose
）
；

⑨
1 liter
（升）
5
×
TBE
备用溶液（
stock solution
）
：

54g tris base
，
27.5g
硼酸（
boric acid
）
，
20ml 0.5 mol/L EDTA , pH 8.0
；

⑩
6
×凝胶加样缓冲液：

0.25%
溴酚蓝（
bromophenol blue
）
，
40%
蔗糖（
sucrose in water
）
；

另外还有的试剂是：胰
RNA
酶、
DNA Marker
、硼酸、
Gelview
试剂


（
2
）实验材料：含有
pUC19
质粒的大肠杆菌等。


4
．实验方法步骤及注意事项

1
）实验方法步骤

第一部分：质粒
DNA
的提取及酶切

（
1
）取
1.4
ml
含
pUC19
这里的大肠杆菌培养物于
1.5
ml
微量离心管中，
4
000
r/min
离心
2
分钟，吸去上清液，并使细胞沉淀尽可能干燥；

（
2
）加
100
?
l
溶液Ⅰ悬浮细菌沉淀，充分混和均匀，室温放置
10 min
；

（
3
）加
200
?
l
溶液

Ⅱ （新鲜配制）
，盖紧管口，轻缓上下
4-6
次颠倒离心管
以混合内容物。将离 心管静置冰上
5 min
（使溶液变透明，粘稠）
；

（
4
）加
200
?
l
溶液

Ⅲ （事先冰上预冷）
，盖紧离心管口后上下轻缓颠倒
4-6
次，置冰上
15 min (
溶液出现白色沉淀
)
；