北京军都医院质粒DNA的提取及检测实验报告

2021年2月2日发(作者：男科包皮)
四川大学实验报告


题目：质粒
DNA
的提取及检测

一．

实
验目的
:
1.

学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；

2.

学习
DNA
琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。

二．

实
验原理

1.
质粒
(Plasmid)
：


一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb
不等，为双链、闭环的
DNA
分子，并以
超螺旋状态存在 于宿主细胞中。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿
主有利的酶的基因，这些基因 的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。

2.
载体
(Vector)
：


要把一个 有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运
载工具，携带外源基因进入 受体细胞的这种工具就叫载体。目前除了大肠杆菌中的质粒、λ
噬菌体、
M13
噬菌体 、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。

3.
分离质粒
DNA
：

（
1
）培养细菌使质粒扩增；

（
2
）收集和碱裂解细菌；

（
3
）分离和纯化质粒
DNA
。

4.
碱裂解法

（
1
）溶液Ⅰ：
50mmol/L
葡萄糖，
10mmol/EDTA-Na
，
25mmol/LTris- HCl (pH8.0)
作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止
DNA
的降解

（
2
）溶液Ⅱ：
0.4mol/L NaOH
，
2% SDS
，临用前
1
：
1
配制

作用：细胞在
NaOH
和
SDS
溶液中裂解时，蛋白质与染色体
DNA
发生变性


1

/
9


四川大学实验报告


（
3
）溶液

Ⅲ

：
5mol/L
醋酸钾
60ml
，冰醋酸< br>11.5ml
，双蒸水
28.5ml
作用：酸性条件上质粒
DNA< br>复性，留在上清液。大肠杆菌
DNA
和蛋白质
-SDS
复合物等发生沉
淀。

5.
电泳


带电荷的物质，在电场 中的趋向运动称为电泳。
DNA
的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为
200bp
至近
50kb
的
DNA
分子。
DNA
的迁移率（
U
）的对数与凝胶浓度（
T
）之间存在反平行线
性关系。因此，要有效地分离不 同大小的
DNA
片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要
的。

6.
提取质粒


在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取 的质粒可能有三种：线性
DNA
、开环
DNA
、
闭环超螺旋
DNA
。当提取的质粒
DNA
电泳时
,
同一质粒
DNA
泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉
开环。但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离 子强度及核酸染料
含量有关。

三．

实
验材料及设备

1.

实验材料：

（
1
）含质粒
pUC18
大肠杆菌，
1.5ml
塑料离心管，
EP
管架，微量取
液器和取液器吸头，常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等）< br>；

（
2
）提取的
pUC18
，琼脂糖，锥形瓶，一 次性手套，胶铲，封口膜，
剪刀，取液器吸头。实验设备：

2.

实验仪器：


2

/
9


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（
1
）恒温摇床，高压灭菌锅，超净 工作台，
10
、
100
、
1000
μ
L
取 液
器各一支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；

（
2
）
电泳仪，
电泳槽，
样品槽模板
（梳子）
，
有机玻璃内槽，
水 平仪，
取液器，微波炉，凝胶成像系统。

3.

实验试剂：

（
1
）质粒的提取


培养液
:
胰蛋白胨
（
Tryptone
）
10g
，
酵母提取物
（
Yeast
extract
）
5g
，NaCl5g
，琼脂（固体培养基）
15g
，用
1N NaOH
调
pH7.5;
b.
溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ；

c.
氨苄青霉素
(50mg/mL)
；

d.
抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇
=25:24:1
）


作用：
氯仿可使蛋白质变性，
有助于液相与有机相的分离。
平衡酚
密 度大，可是
DNA
在上清中。异戊醇防止抽提液起泡。

e.
无水乙醇

作用：除去
DNA
水化层，使
DNA
沉淀。

f.70%
乙醇

作用：纯化质粒
DNA
。


缓冲液或
ddH2O
作用：溶解
DNA

3

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四川大学实验报告


（
2
）
DNA
琼脂糖凝胶电泳检测

a. Gold view
（
DNA
染料）

b.1
×
TAE
缓冲液

c.
上样缓冲液（
6
×）

四．

实
验方法及步骤

1.

质粒
DNA
的提取

a)

将带有质粒
p UC18
的大肠杆菌接种在液体培养基中
（加氨苄青霉
素
50
μg/mL
）
，
370C
培养过夜；

b)
< br>取培养菌液
1.5mL
置
Eppendorf
小管中，
100 00rpm
×
2min
，弃上
清液；

c)
加入
100
μ
L
溶液
I
，
漩涡器上充分混匀，
在室温下放置
10
min
；

d)

加 入
200
μ
L
新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转
2~3
次，使之混 匀，冰
上放置
5 min
；

e)

加入
150
μ
L
冰冷的溶液Ⅲ，盖紧后，温和颠倒
3-5
次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置
15 min
；

f)

10000rpm
×
5 min
，取上清液于另一干净的离心管中；

g)

向上清液中加入 等体积
（约
400
μ
L
）
酚：
氯仿
/异戊醇
（
25
：
24:1
，
v/v
）
，振荡混匀，
10000rpm
×
10
min
，将上清液转移至新的离
心管中；


4

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