微管人流DNA重组技术实验报告

2021年2月2日发(作者：南京口腔医院)

一、
实验名称：

重组
DNA
技术


二、
实验目的
：

1.

了解掌握
DNA
重组技术理论基础；

2.

掌握质粒载体、外源
DNA
的准备、酶切、连接技术方法；

3.

掌握连接产物的转化方法及操作；

4.

掌握阳性重组体的的鉴定和筛选方法；


三、实验原理
:
1.

重组
DNA
技术

重组
DNA技术是指
在体外通过人工
“
剪切
”
和
“
拼接< br>”
等方法，对各种生物的
核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞 内，使重组基因
在细胞内表达，
产生出人类需要的基因产物，
或者改造、
创造 新特性的生物类型
的技术。
它主要包括以下几个步骤：

①目的基因的获取： 主要有化学合成、
PCR
、基因组文库、
cDNA
文库构建
等。cDNA
文库是以
mRNA
为模板，利用反转录酶合成与
mRNA
互补的
DNA
，
再复制成双链
cDNA
片段，
与适当载体 连接后转入受体菌，
这些受体菌包含了所
有
cDNA
信息，总称
cD NA
文库

。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。基因组
DNA
文库 是利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体
DNA
切割后，
与适当载
体连接 后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组
DNA
信息，因此称为基因
组
D NA
文库。

②基因载体的选择与构建：常用载体有质粒、噬菌体、病毒
DN A
等。分为
克隆载体和表达载体。克隆载体：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等。
表达载体：
用于在宿主细胞中表达外源目的基因，
获得大量表达产< br>物。选择好的载体与目的基因利用限制性内切酶切割成合适片段。

③目的基因与载体的 拼接：通过粘性末端连接法（同源互补粘性末端连接、
非同源互补粘性末端连接）、平端连接、人工接头 连接、同聚物接尾、经部分补
平的不匹配末端的连接等将目的基因与载体进行连接。

④重组
DNA
分子导入受体细胞：
将连接有目的
DNA
的载体导入宿 主细胞，
主要有以下几种方法：
a
、转化：将质粒或其它外源
DNA
导入宿主细胞
(
常用大
肠杆菌
)
，并使其获得新的表型的过程。b
、转染：将外源
DNA
导入真核细胞的
过程。
c
、感 染：以
λ
噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组
DNA
分子，在体外
经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，
才能感染适当的细胞，
并在细胞
内扩增 。

⑤重组体的筛选：
可通过遗传标记如抗药性标志选择、
营养缺陷型的互补 筛
选法及分子标记（
PCR
、分子杂交）等直接筛选或是根据免疫化学法、酶联免疫< br>检测法等进行间接筛选。


⑥无性繁殖转化子
(
含重组分子的受体细胞
)
⑦目的基因的表达

2
、质粒酶切及鉴定原理

限制性内切 酶是一种工具酶，其特点是具有能够识别双链
DNA
分子上的特
异核苷酸序列的能力， 能在这个特异性核苷酸序列内，切断
DNA
双链，形成一
定长度的
DNA序列。根据限制性内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有
修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类，

II
型限制性内切酶只需要二价镁离子的激
活，
酶在其识别序列内 切割双链
DNA
，
产生的各种
DNA
片段具有相同的末端结
构，而且大多数的
II
型酶可提供粘性未端，有利于片段再连接，限制性内切酶
对环状 质粒
DNA
产生的酶切片段数与切口数一致。因此，鉴定酶切后的片段在
电泳凝胶的区 带数，
就可以推断切口的数目
;
从片段迁移率可判断酶切片段大小。
用已知分 子量的线状
DNA
为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分
子形状相同的未 知
DNA
的相对分子大小。
本实验采用的限制性内切酶是
Bam HI
和
Hind III
。


对于
DNA
回收，回收的目的是为了纯化提取的质粒，以用于以后的分子
杂交、重组质粒的构建、序列分析等。目 前常用的回收技术有：柱纯化回收法、
电洗脱法、低熔点琼脂糖凝胶法、
DEAE
滤膜 插片法等，其中柱纯化回收法、电
洗脱法，
经济节省，
操作方便，
对
DNA
回收效果好。
本实验采用试剂盒回收
（柱
纯化回收法）
，其原理是采用凝胶裂解液融化凝胶，
采用特殊的收集管收集
DNA
后，漂洗液洗脱 杂质，最后用洗脱液洗出
DNA
。


四、主要实验仪器
：
不同规格移液器、
EP
管、常规电泳仪、紫外灯、恒温水
浴箱、常规台式离心 机、恒温孵箱、
CP3
吸附柱、收集管、培养皿、酒精灯、玻
璃涂布棒等。


五、主要实验试剂
：

1.
酶切相关试剂：
p UC18DNA
、
λDNA
（
TIANGEN, MD202
）
、
Hind III
（
Thermo,
ER0501
）、
Buffer R (10X)
（
Thermo, BR5
）、
BamHI
（
Thermo, ER0051
）、
BamHI-Lsp1109I Buffer (10X)
（
Thermo, B57
）
、
pUC18-mir203
质粒
DNA
（老
师提供）。

2.
电泳相关试剂：
琼脂糖、
GoldView
、
1kb DNA Ladder
（
TIANGEN
，

MD111
）
、
DNA
电泳
loading buffer
（
6X
）（
TIANGEN, RT201-01
），电泳缓冲液。

3
、
凝胶
DNA回收：
小量琼脂糖凝胶
DNA
回收试剂盒
（庄盟国际生物，
ZP 202
）
。

4.
重组体构建相关试剂：
T4
DNA
连接酶
(Thermo,
EL0014)
、
10X
T4
DNA
连接
buffer( Fermentas, 00044933)
。

5.
转化相关试剂：
感受态细胞（本实验 用感受态细胞
DH5
α
从公司购买）、
LB
培养基（老师提供）、含
Amp
琼脂糖平皿（老师提供）、质粒小量提取试剂
盒（庄盟国际生物，
ZP 101
）、
ddH
2
O
等。


六、实验步骤
：

1.
载体
pUC18
和目的
DNA
酶切

（
1
）质粒
DNA
酶切反应体系：

试剂

pUC18DNA (5ug)
10
×
buffer
Hind
Ⅲ

(15U)
ddH
2
O

total

体积

(ul)
2.5
2
5
10.5
20
反应条件：
37
℃恒温水浴，

2hr
；室温下放置等待连接。

（
2
）目的
DNA
酶切反应体系：

试剂

λDNA(5ug)

10
×
buffer
Hind III(9U)
ddH
2
O

total

反应条件：
37
℃恒温水浴，

2hr
；

体积

(ul)
10
2
3
5
20
（
3
）质粒载体双酶切反应体系：

试剂

pUC18-mir203
质粒
DNA(4
μ
g)

10
×
buffer
Hind III(9U)
Bam HI

ddH
2
O

total

反应条件：
37
℃恒温水浴，

2hr
；

根据以上反应体系配制好后，瞬时离心后置于
37
℃恒温水浴锅中反应。

体积

(ul)
25
5
2
1
17
50
2.

目的
DNA
酶切片段电泳鉴定

（
1
）

配制
1%
琼脂糖凝胶：
称取
0.5
克琼脂糖，置于锥形瓶内 ，加入
50ml
1
×
TAE
，瓶口用保鲜膜封盖，在微波炉中加热 直至琼脂糖全部溶解，得到
1
%
琼脂糖凝胶液，待其冷却至
65
℃左右，加入
2.5
μ
L
GoldView
。小心混匀并倒在
制胶槽中，控制灌胶速度 ，使胶液缓慢展开，避免产生气泡，待胶凝固完全后，
轻轻拔出梳子。将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没 过胶面
1mm
深的足够电泳缓
冲液，准备电泳。

（
2
）

电泳：
取
20uL
酶切后产物，加入
4uL
DNA
电泳
loading
buffer
混匀，
上样20uL
。
恒压
90V
电泳
40-60min
。

（
3
）

紫外灯下观察结果并切胶用于后续试验。

3.
目的
DNA
凝胶条带切割及目的
DNA
回收

根据试剂盒说明书操作

（
1
）将单一的目的

DNA
条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入
干净的离心管中，称取重 量，约
0.3g
。


（
2
）向胶块中加入
3
倍体积溶胶液（
900
?
l
），
55
℃
,
水浴
10
分钟左右，其间 不
断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

（
3
）
将上一步所得溶液加入一个吸附柱中


（吸附柱放入收集管中）
，
12,000 rpm
(~13,400
×
g )
离心

1
分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

（
4
）
向吸附柱中加入

600
μ
l
漂洗液

W2
（使用前加入无水乙醇）
，
12,000 rpm
(~13,400
×
g )
离心

1
分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

（
5
）向吸附柱中加入

500
μ
l
漂洗液

W2
，
12,000 rpm (~13,400
×
g )
离心

1
分
钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。


（
6
）将吸附柱放入收集管中，
12,000 rpm (~13,400
×
g )
离心

2
分钟，尽量除去
漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。

（
7
）将吸附柱放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加
50
μ
l
的洗
脱缓冲液

TE
，
12,000 rpm (~13,400
×
g )
离心

1
分钟，收集

DNA
溶液。

4.
连接目的
DNA
和酶切后的质粒
DNA

反应体系：