福兴医院DNA连接试验

2021年2月2日发(作者：孙旗)
.
DNA
连接试验

当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载
体，

并确定重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段之间的体外连接，从而
获得重组子。

此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的
基因表达
（如现代基因 工程药物的生产）
，
还可用于序列分析和转基因等重要生
物技术的研究中。

DNA
连接实验原理：

ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，

由ＤＮＡ连接酶催化两个双链
ＤＮＡ片段组邻的５
’
端磷酸与３
’< br>端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程，

ＤＮＡ分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。

带有相同末端< br>(
平端或粘端
)
的外源
DNA
片段必须克隆到具有匹配末端的 线
性质粒载体中
,
但是在连接反应时
,
外源
DNA
和质粒都可能发生环化
,
也有可能形
成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两 个
DNA
的浓度，以便使
“
正
确
”
连接产物的数 量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除
5’
磷酸基团
以抑制载体
D NA
的自身环化。利用
T4
DNA
连接酶进行目的
DNA
片段和载体
的体外连接反应，也就是在双链
DNA
5’
磷酸和相邻的
3’
羟基之间形成新的共价
键。如载体的两条链都带有
5’
磷酸（未脱磷） ，可形成
4
个新的磷酸二酯键；如
载体
DNA
已脱磷，则只能形成< br>2
个新的磷酸二酯键，此时产生的重组
DNA
带
有两个单链缺口，在导 入感受态细胞后可被修复。

不对称粘性末端：
两种限制酶消化后，
需纯化载 体以提高连接效率；
载体与
外源
DNA
连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；
外源
DNA
可以定向插入到载体中。

对称性粘性末端；线形载体
DNA
常需磷酸酶脱磷处理；载体与外源
DNA
连 接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源
DNA
的串联拷贝；外源
DNA< br>会以两个方向插入到载体中。


3
、

平端：要求 高浓度的
DNA
和连接酶；载体与外源
DNA
连接处的限制
酶切位点 消失；
重组质粒会带有外源
DNA
的串联拷贝；
非重组克隆的背景较高

。

粘性末端连接：

实验试剂：

用适当的 限制酶消化质粒和外源ＤＮＡ。
如有必要，
可用凝胶电泳分离片段
并（或）用碱性磷酸 酶处理质粒ＤＮＡ。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化ＤＮ
Ａ，然后用
TE(pH7.6)溶液使其浓度为
100/ml
。

10×
T4DNA
连 接酶
buffer
（该缓冲液应分装成小份，贮存于－
20
℃。）：
200mMTris-HCl(pH7.6)
；
50mMMgCl2
；
50m M
二硫苄糖醇

'.
.
500μl/ml BSA
（可用可不用）

T4DNA
连接酶
%

5mM ATP
实验步骤：

1
、

在无菌
Eppendorf
管中加入以下溶液：

1) 10μl< br>体积反应体系中：取载体
50-100ng
，加入一定比例的外源
DNA 分
子
（一般线性载体
DNA
分子与外源
DNA
分子摩尔 数为
1
∶
1-1
∶
5
）
，
补足
d dH2O
至
8μl
。

2)
轻轻混匀，稍加离心，于
45
℃水浴５分钟使重新退火的粘端解链，

迅速将
混合物转入冰浴。

3)
加入含
ATP
的
10×Buffer
1μl
，
T4
DNA
连接酶合适单位，

用
ddH2O
补至
10μl
。

2
、

盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心５秒。

3
、

１２℃下过夜连接反应。

4
、

反应结束后于－２０℃保存。

5
、

再设立两个对照反应 ，其中含有（１）只有质粒载体；（２）只有外源
ＤＮＡ片段。
如果外源ＤＮＡ量不足，
每个连接反应可用
50-100ng
质粒ＤＮＡ，
并尽可能多加外源ＤＮＡ，同时保 持连接反应体积不超过
10μl
。可用至少３种
不同方法来测定Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接 酶的活性。


注意事项：

1
、

连接 反应的温度：
ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃，
但在此温度
下，

粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过夜。

2
、
< br>DNA
的平未端和粘性末端：
由于内切酶产生的
DNA
末端有平未端和 粘
性末端，
因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。

二者连接效率不同。
粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。

3
、

碱性磷酸酶处理质粒载体：
为了提高连接效率，
一般 采取提高ＤＮＡ的
浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮＡ自生连接问题，

为此 通常选择对
质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５
’
末端的磷酸基，防止环化，

通过接反应
后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。

4
、

连接反应的检测：连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，
转化宿主菌，

阳性克隆的筛选来确定。

5
、

如果要检验连接酶和连接 酶专用的缓冲液是否有效，
可重新连接酶切后
的
λDNA
。若连接成功，则说 明有效。

平端
DNA
连接：

'.