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唇裂手术多少钱质粒DNA的提取、纯化及验证

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-02-02 17:53

四川妇科-心脏病症状

2021年2月2日发(作者:博罗人民医院)
质粒
DNA
的提取、纯化及验证

姓名:肖风

学号:
2 2010
级生物工程

一、
【实验目的】

1


掌握碱变性提取法的原 理及各种试剂的作用,
掌握碱变性法提取质粒
DNA
的方法。

2

、掌握质粒
DNA
的纯化方法,即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。

3

、学习并掌握凝胶电泳进行
DNA
的分离纯化的实验原理,凝胶 的制备及电
泳方法及凝胶中
DNA
的分离纯化方法。

二、
【实验原理】

1
、碱变性提取法

提取和纯 化质粒
DNA
的方法很多,
目前常用的有:
碱变性提取法、
煮沸法、
羟基磷灰石柱层析法、
EB
一氯化铯密度梯度离心法和
Wizard
法等。其中,碱变
性提取法最为经典和常用,
适于不同量质粒
DNA
的提取。
该方法操作简单,
易于
操作,一般实验室均可进行。提取的质粒
DNA
纯度高,可直接用于酶切、序列测
定及分析。

碱变性提取质粒
DNA一般包括三个基本步骤:培养细菌细胞以扩增
质粒;收集和裂解细胞;分离和纯化质粒
DN A


在细菌细胞中,
染色体
DNA
以双螺旋结构存在,< br>质粒
DNA
以共价闭合环状形式存
在。
细胞破碎后,
染色体< br>DNA
和质粒
DNA
均被释放出来,
但是两者变性与复性所
依 赖的溶液
pH
值不同。

pH
值高达
12

0
的碱性溶液中,
染色体
DNA
的氢键断
裂,
双螺旋结构 解开而变性;
共价闭合环状质粒
DNA
的大部分氢键断裂,
但两条
互 补链不完全分离。
当用
pH

4

6

K Ac(

NaAc)
高盐溶液调节碱性溶液至中
性时,变性的质粒
D NA
可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中;
但染色体
DNA
不能复性,而是与不稳定的大分子
RNA
、蛋白质一
SDS
复合物等一
起形成缠连的、
可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心,
与复性的溶于溶液的质粒
DNA
分离。溶于上清液的质粒
DNA
,可用无水乙醇和盐溶液,使 之凝聚而形
成沉淀。由于
DNA

RNA
性质类似,乙醇沉淀
DNA
的同时,也伴随着
RNA
沉淀,
可利用
RNase A

RNA
降解。质粒
DNA
溶液中的
RNase A以及一些可溶性蛋白,
可通过酚/氯仿抽提除去,最后获得纯度较高的质粒
DNA


2
、琼脂糖凝胶电泳

凝胶电泳技术操作简单而迅速,分辨率高 ,分辨范围极广。此外,凝胶中
DNA
的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭
( EB)

SYBR
Gold
染色直接观
察到,
甚至含量少至
20
Pg
的双链
DNA
在紫外激发下也能直接检测到。
需要的话,
这些分离的
DNA
条带可以从凝胶中回收,用于各种各样目的的实验。

分子生物学实验中,< br>常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。
这两种凝胶能
灌制成各种形状、
大 小和孔径,
也能以许多不同的构型和方位进行电泳。
琼脂糖
凝胶电泳易于操作,
适用于核酸电泳,
测定
DNA
的相对分子质量,
分离经限制酶
水解 的
DNA
片段,进一步纯化
DNA
等。

琼脂糖凝胶电泳是 一种常用的方法。在溶液中,由于核酸有磷酸基而带负电荷,
在电场中向正极移动。
DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面
6

因素:

( 1)
样品
DNA
分子的大小

电泳时,
线性双螺旋
DNA
分子是以头尾位向前迁
移的,
其迁移速度与相对分子质量
(
所 含碱基
)
的对数值成反比,
这是因为大分子
有更大的摩擦阻力。
< br>(2)DNA
分子的构象:相对分子质量相同而构象不同的
DNA
分子,其迁移 速率不
同。
在抽提质粒
DNA
过程中,
由于各种因素的影响,
使超螺旋的共价闭合环状结
构的质粒
DNA(covalently closed circular DNA

cccDNA)
的一条链断裂,变成
开环
DNA(open circle DNA

oeDNA)
分子,如果两条链发生断裂,就转变为线状DNA(1iner
DNA

L
DNA)
分子。这三种构型 的分子有不同的迁移率。一般情况下,
超螺旋型迁移速度最快,其次为线状分子,最慢的是开环状分子。

(3)
琼脂糖浓度:
琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径,一定大小的
DNA
片段
在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。
通常凝胶浓度越低,
则凝胶孔径越
大,
DNA
电泳迁移速度越快,
因此,
相对分子质量越 大,
选用的凝胶浓度应越低。

(4)
电泳所用电场:
低电压条件下 ,线性
DNA
片段的迁移速率与所用电压
成正比,电压越高,带电颗粒泳动越快,但随 着电场强度的增加,不同长度
DNA
泳动的增加程度不同,因此凝胶电泳分离
DNA< br>的有效范围随着电压上升而减少。
为了获得
DNA
片段的最佳分离效果,电场强 度应小于
5 V

cm


(5)
缓冲液:
缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。
当电泳液为去离
子水
(
如不慎误 用去离子水配制凝胶
)
,溶液的导电性很少,带电颗粒泳动很慢,
DNA
几乎 不移动;
而在高离子强度下
(
如错用
10
×电泳缓冲液
)< br>,
导电性极高,

电颗粒泳动很快,产生大量的热,有时甚至熔化凝胶或使DNA
变性。


(6)
温度:
琼脂糖凝胶电泳时,< br>不同大小
DNA
片段的相对电泳迁移率在
4

30
℃ 内无变化,一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行,而当琼脂糖含量少于
0

5
%时,凝胶很脆弱,最好在
4
℃下电泳以增加凝胶强度。


三、
【实验材料】

恒温振荡培养箱,高速冷冻离心机,漩涡振荡仪,水浴锅 ;
1.5mL
离心管,
50mL
离心管,不同型号的吸头,微量移液器等。< br>
菌体:
DH5
α
受体菌,具有
Ampr
标记的质粒
pUC19
微 波炉,电泳仪,制胶槽,电泳槽,梳子,锥形瓶,电子天平,手套,紫外灯,
Eppendorf
管,刀片,塑料薄膜等。

酶切后的
DNA
样品或其他待分离纯化的
DNA
样品;琼脂糖,
TAE
缓冲液,溴化乙
锭(
EB


6
×上样缓冲液,
DNA
相对分子质量标准物
DNA Marker
λ
/Hind III

5 mol/L pH5.2
的醋酸钠,无水乙醇。


四、
【实验步骤】

(一)
、实验前准备



1

LB
培养液
+1%
葡萄糖

按照附录 所示配方配制
LB
培养液,并添加
1%
葡萄糖,
115
℃灭 菌
30min

分别分装于
100mL
锥形瓶中
20mL< br>,
300mL
锥形瓶中
50mL
;同时配制固体培养基
用于活 化菌株。

2
、枪尖:
1000
μ
L
(蓝色)
200
μ
L
(黄色)

20
μ
L< br>(白色)
,灭菌备用

3
、离心管:
1.5mL
离心 管于
500mL
锥形瓶中,
50mL
离心管
2
支,灭菌备用

4
、吸管:
10mL
吸管,灭菌备用

(二


、质粒提取

1
、细胞培养
< br>在含有氨苄青霉素的
LB
平板上挑去携带有质粒
pUC19


单菌落,接种

20mL
含氨苄青霉素的
LB
液体培养基中 ,
37
℃振荡培养过夜。
将过夜培养液吸

2

3 mL
接种到
50mL
含有氨苄青霉素的
LB
培养基中,
37
℃培养
4

6h
,即到
达菌体生长的对数晚期。


2


质粒提取

2.1.

30mL
菌液于
50mL
灭菌离心管中,

7000r/min< br>条件下离心
5min

弃去上清液,收集菌体细胞。空管质量为
15. 570g


2.2.
向离心管中加入
5mL
冰箱预冷的 溶液Ⅰ,
加入溶液
I
主要是为了打散
菌体,
使菌体沉淀转变成为均匀 的菌悬液,
为下一步破碎菌体做准备,
可剧烈振
荡,此时细胞尚未破裂,不用担心染色 体断裂。为节省时间,可在漩涡振荡仪上
混匀。通过步骤(
1
)离心,弃去上清液,将 离心管倒置,使上清液全部流尽,
用吸水纸擦干,称量菌体质量,为
15.742-15.57 0=0.172g


2.3.
按湿菌体质量:溶液
I
体 积
=100mg

1mL
的比例加入用冰箱预冷的溶

I< br>(
2mL

,剧烈振荡,使细菌完全分散,将离心管置于碎冰中冰浴
5 min
2.4.

2
倍体积加入新配制的溶液Ⅱ

4m L


轻摇轻加,
至半透明溶液形
成。此步是
DNA
变性的关键步骤,加入溶液
II
后,菌悬液
pH
上升到
12
左右,
为强碱性,
破坏大肠杆菌

G-

细胞壁,
此时,
溶液变粘稠、
透明,无菌块残留,
因为染色体
DNA
与质粒
DNA
均变性溶解于强碱溶液中,
蛋白质也溶于溶液中,

质粒DNA
双链不完全分离。
因此步染色体
DNA
释放,
故动作必须 轻柔,
不能剧烈
震荡,否则染色体
DNA
会断裂成小片段,不形成沉淀,而溶 解于溶液中,与质粒
DNA
混合在一起,不利于质粒
DNA
提纯。可缓慢上下 颠倒离心管数次,既要使试
剂与染色体
DNA
充分作用,又不破坏染色体的结构。
2.5.

1.5
倍溶液
I
体积量加入冰箱预冷的 溶液Ⅲ

3mL


轻加轻摇,

慢颠倒数次,使 之在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,然后将离心管置于冰上
10min

此时有白色絮 状沉淀物。
此步是质粒
DNA
复性的关键步骤。
动作要轻柔,
理由同 上。同时可减少对质粒
DNA
的破坏,使其保持超螺旋闭环结构。

2.6.
12000r/min
离心
15min
,将上清液轻轻转移到另一洁净离心管 中,
向上清液中加入
1/10
体积的
3mol/mL

NaAc

2
倍体积的冰无水乙醇,
混匀,
-20
℃下静置
30min
,沉淀
DNA


2.7.
如(6
)中离心
15min
,小心弃去上清液,将离心管倒置于纸巾上,

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