治疗皮肤过敏的方法16SrDNA 实验原理

2021年2月2日发(作者：神经节苷酯)
一、

实
验
原
理

随着分子生物学的迅速 发展，
细菌的分类鉴定从传统的表型、
生理生化分类
进入到各种基因型分类水平，如< br>(G+C)mol%
、
DNA
杂交、
rDNA
指纹图、质粒< br>图谱和
16SrDNA
序列分析等。

细菌中包括有三种核糖体
RNA
，
分别为
5SrRNA
、
16SrRNA
、
23SrRNA
，
rRNA
基因由保守区和可变区组成。
16SrRNA< br>对应于基因组
DNA
上的一段基因序列称
为
16SrDNA
。
5SrRNA
虽易分析，但核苷酸太少，仅几十
bp
，没有足够的遗传
信息用于分类研究；
23SrRNA
含有的核苷酸数几乎是
16SrRNA
的两倍，分子量
太大，分析较困难。而
16SrRNA
相对分子量在
2kb< br>左右，较为适合
PCR
扩增，
又具有保守性和存在的普遍性等特点，
序 列变化与进化距离相适应，
序列分析的
重现性极高，因此，现在一般普遍采用
16Sr RNA
作为序列分析对象对微生物进
行测序分析。

16SrRNA
的编码基因是
16SrDNA
，
但是要直接将
16SrRNA
提取出 来很困难，
因为易被广泛存在的
RNase
降解，因而利用
16SrDNA< br>鉴定细菌，其技术路线如
下：

细胞培养液


DNA
提取


基因组
DNA
PCR
扩增



16SrDNA
片
段

片段回收

PCR
实验原理

连接克隆载
体

阳性克隆鉴
定

测序

即聚合酶链式反应，是指在
DNA
聚合酶催化下，以母链
DNA
为模板，以
特定引物为延伸起点，通过变 性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板
DNA
互补的子链
DNA
的过 程。是一项
DNA
体外合成放大技术，能快速特异地
在体外扩增任何目的
DN A
。

二、主要器具及试剂

PCR
、电泳系统、
DNA
提取体系、
TaqPolymerase
、
DNAMarker
，溶菌酶、
dNTP
和感受态细胞、
pMD18-TVector
、琼脂糖 、
SDS
裂解缓冲液、
50×
TAE
电
泳缓冲液贮存液、< br>1
×
TE
（）

三、操作方法

1.
细菌基因组总
DNA
的提取

接种纯化的菌株于
LB
液体培养基中，
180r/min
，
37
℃培养过夜，按以下的
方法提取细菌基因组总
DNA
。

( 1)
菌体收集：取新鲜的菌液于
EP
管中，
12000r/min
离 心
30s
，弃净上清，
收集菌体。

(2)
辅助裂解：加< br>100μg/mL
溶菌酶
50μL
，
37
℃处理
30min
。

(3)
裂解：
向每管加入< br>200mL
预冷的
SDS
裂解缓冲液，
用吸管头迅速强烈抽
吸 以悬浮和裂解细菌细胞。

(4)
向每管加入
66μL5mol/LNaCl
，充分混匀后，
12000r/min
离心
10min
，除
去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。

(5)
将上清转移到新
EP
管中 ，加入等体积的
Tris-
饱和酚，充分混匀，
12000r/min
离心< br>3min
，进一步沉淀蛋白质。

(6)
取离心后的水层，加等体积的 氯仿
/
异戊醇（体积比
24
：
1
），充分混匀
后，
12000r/min
离心
3min
，去除苯酚。

(7)
小心取上清，用预冷
2
倍体积的无水乙醇沉淀
DNA
，
13 000r/min
离心
15min
，弃上清。

(8)
用
400μL75%
的乙醇洗涤沉淀
2
次。

(9)
室温干燥后，用
40μL1×TE
溶解
DNA
。
(10)%
琼脂糖凝胶电泳检测基因组
DNA
。

(11)
提取的基因组总
DNA-40
℃冰箱保存备用。

扩增细菌的
16SrDNA
(1)16SrDNA
的
PCR
引物：采用细菌的通用引物
27F
和
1492R
(2)PCR
反 应体系为（
20
μL
）：灭菌蒸馏水
μL
，

10
×
buffer2
μL
，

10mmol/
μL
，