危险期体外分子生物学实验

2021年2月2日发(作者：秃顶怎么办)
分子生物学实验

1.
幸免长时刻的培养，大肠杆菌一样培养
12
个小时就能够挑取克隆
子进行验证了。

要紧是因为培养时刻过长，专门是含 有
Amp
抗性的质粒。重组菌能
够分泌酶降解
Amp
，造成平板中局 部
Amp
浓度太低。其他未重组菌在
A
mp
存在的情形下只是生长受 抑制而非死亡，当
Amp
浓度降低时就能够生
长了。卫星菌落，由于阳性菌落大量分解 抗生素，造成周围区域抗生素浓
度降低，则无抗性的菌也生长出来了。一句话，你的板子培养时刻过长< br>了。这是
amp
抗性质粒特有的卫星菌落，确实是又抗性的
E col
分泌
beta
内酰胺酶分解周围的
amp
，从而使没有抗性的
e coli
生长。



2.3.
乙醇能够排除核酸的水化 层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。
Na
＋之类的平稳离子能够与这些带电基团结合，在沉淀 形成部位降低多核
苷酸链之间的排斥作用。因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基
的电 荷时才会发生乙醇沉淀。
1.
什么原因用无水乙醇沉淀
DNA
？


用无水乙醇沉淀
DNA
，这是实验中最常用的沉淀
DNA
的方法。乙醇
的优点是能够任意比和水相混溶，乙醇与核酸可不能起任何化学反应，对
DNA< br>专门安全，因此是理想的沉淀剂。


DNA
溶液是
DNA< br>以水合状态稳固存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去
DNA
周围的水分子，使
DN A
失水而易于聚合。一样实验中，是加
2
倍体
积的无水乙醇与
DNA
相混合，其乙醇的最终含量占
67
％左右。因而也可
改用
95
％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比
95
％乙醇昂
贵）
。然 而加
95
％的乙醇使总体积增大，而
DNA
在溶液中有一定程度的溶
解，因而
DNA
缺失也增大，专门用多次乙醇沉淀时，就会阻碍收得率。
折中的做法是 初次沉淀
DNA
时可用
95
％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀
步骤要 使用无水乙醇。也能够用
0.6
倍体积的异丙醇选择性沉淀
DNA
。一
样在室温下放置
15
－
30
分钟即可。


< br>2.
在用乙醇沉淀
DNA
时，什么原因一定要加
NaAc
或< br>NaCl
至最终浓
度达
0.1
～
0.25mol/L
？


在
pH
为
8
左右的溶液中，
DNA
分子是带负电荷的，加一定浓度的
N
aAc
或
NaCl
，使
Na+
中和
DNA
分子上的负电荷，减少
DNA
分子之间的 同
性电荷相斥力，易于互相聚合而形成
DNA
钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓
度 太低时，只有部分
DNA
形成
DNA
钠盐而聚合，如此就造成
DNA
沉淀
不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其成效也不行。在沉淀的
DNA
中 ，由于过多的盐杂质存在，阻碍
DNA
的酶切等反应，必须要进行洗涤
或重沉淀。用无 水乙醇沉淀
DNA
，这是实验中最常用的沉淀
DNA
的方
法。乙醇的 优点是能够任意比和水相混溶，乙醇与核酸可不能起任何化学
反应，对
DNA
专门安全 ，因此是理想的沉淀剂。


DNA
溶液是
DNA
以水合状 态稳固存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去
DNA
周围的水分子，使
DNA
失水 而易于聚合。一样实验中，是加
2
倍体
积的无水乙醇与
DNA
相混合 ，其乙醇的最终含量占
67
％左右。因而也可
改用
95
％乙醇来替代 无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比
95
％乙醇昂
贵）
。然而加
9 5
％的乙醇使总体积增大，而
DNA
在溶液中有一定程度的溶
解，因而
DNA
缺失也增大，专门用多次乙醇沉淀时，就会阻碍收得率。
折中的做法是初次沉淀
DNA
时可用
95
％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀
步骤要使用无水乙醇。 也能够用
0.6
倍体积的异丙醇选择性沉淀
DNA
。一
样在室温下放 置
15
－
30
分钟即可。
1
。
DNA
不溶 于乙醇

2
。乙醇能够吸附水分子（极性相同）
，使得溶液中相对的水分子减
少，增大了
DNA
在水中的相对浓度。

3
。附：乙醇沉淀
DNA
需要盐离子，用金属离子屏蔽
DNA
上磷酸的
负电荷，降低< br>DNA
分子间的斥力，才能沉淀完全。

4.
溶菌酶是一种碱性球蛋 白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族
氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。

溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或
N-
乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中
N-
乙酰胞壁酸与
N
-
乙酰氨基葡萄糖之间的
β
-1
，
4
键，从而破坏细菌的细 胞壁，使之松驰而
失去对细胞的爱护作用，最终使细菌溶解死亡。也能够直截了当破坏革兰
氏阳 性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这要紧是因为革兰氏阳性细菌的
细胞壁要紧是由胞壁质和磷酸质组成 ，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成
的糖蛋白，这种多糖正是由
N-
乙酰胞壁酸与N-
乙酰氨基葡萄糖之间的
β
-
1
，
4
键联结 的。对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏
菌，也会受到溶菌酶的破坏。溶菌酶是母乳中 能爱护婴儿免遭病毒感染的
一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还能够使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还能够促进蛋白质的消化吸
取

5.
酚、氯仿是变性蛋白质的（由于苯酚能溶进少量水缺失
DNA
，因
此与氯仿一 起使用，减少
DNA
缺失）

异戊醇是消泡剂（蛋白质变性中常常产动气泡， 会缺失
DNA
，因此
需消泡）抽提
DNA
去除蛋白质时，如何样使用 酚与氯仿较好？酞与氯仿
是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质
分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。通过
离心，变性蛋白质的密度比水 的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相
下面，从而与溶解在水相中的
DNA
分开。 而酚与氯仿有机溶剂比重更
大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约
10
％～
15< br>％的水溶解在酚相中，因而缺失了这部分水相中的
DNA
，而氯仿的变
性作用不 如酚成效好，但氯仿与水不相混溶，可不能带走
DNA
。因此在
抽提过程中，混合使用 酚与氯仿成效最好。经酚第一次抽提后的水相中有
残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变 性蛋白质，现在一
起将酚带走。也能够在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（
1:1
）使 用。



10
．什么原因用酚与氯仿抽提
DNA
时，还要加少量的异戊酵？在抽
提
DNA
时，为了混合平均，必须剧烈振荡容器数次， 这时在混合液内易
产动气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张
力， 因此能减少抽提过程中的泡沫产生。一样采纳氯仿与异戊酵为
24
：
1
之比。 也可采纳酚、氯仿与异戊醇之比为
25
：
24:1
（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份
24
：
1
的氯仿与异戊醇即成）
，同时异戊 醇有助于分
相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相坚持稳
固。
1.
酚
/
氯仿
/
异戊醇的作用：从核酸样品中除去蛋白质经常常使用 酚和氯
仿都能使蛋白质变性，并使其溶于有机相或中间相内，而异戊醇则有助于
排除抽提过程中 显现的气泡。

6.
β
-
巯基乙醇是抗氧化剂
,
有效地防止酚氧化成醌
,
幸免褐变
,
使酚容易
去除

7.

8.
讲得对。
75%
乙醇清洗
DNA
的目的是脱盐的。

其机理如下：
75%
乙醇中含有
25%
的水，这部分水能够溶解和
DNA
沉淀中混有的、
DNA
沉淀前加入的钾盐（或钠盐）
，但同时也会溶解 （缺
失）少部分
DNA
（盐离子比
DNA
更易溶于水中）
。 为了减少
DNA
缺失，
因此用含量较高的乙醇溶液（
DNA
不溶于乙 醇）
。蛋白质、糖、脂类等都
能够溶于
75%
酒精，而
DNA
不溶

9.

10. RNase A
的作用是使
RNA
降解，减少提取得到的
DNA
中的
RN
A
，以便减少对后续 实验的阻碍。
RNaseH
是一种逆转录酶。消化
mRNA
用的。
R Nase H
，即
Ribonuclease H
，中文名为核糖核酸酶
H< br>，是一种核糖
核酸内切酶，能够特异性地水解
DNA- RNA
杂合链中的
RNA
。
RNase H
不
能水解单链或 双链
DNA
或
RNA
中的磷酸二酯键，即不能消化单链或双链
DNA
或
RNA
。



特点：特异性消化
DNA-RNA
杂合链中的
RNA
，常
用 于
cDNA
第二链的合成

编辑本段用途

·

在
cDNA
第二链合成前去除
mRNA


·
DNA-RNA
杂交体的鉴
定



·

在
Oligo(dT)
存在下去除
mRNA
的
poly(A)
尾

11.
当菌体在
NaOH
和
SDS
溶液中裂解时，蛋白质与
DNA
发生变
性，当加入 中和液后，质粒
DNA
分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心
时留在上清中；蛋白质与 染色体
DNA
不变性而呈絮状，离心时可沉淀下
来。破细胞的要紧是碱，而不是
SDS
，因此才叫碱法抽提。
0.2 N NaOH
：
是最佳的溶解细胞的 试剂，不管是大肠杆菌依旧哺乳动物细胞，碰到了碱
都会几乎在瞬时就溶解，这是由于细胞膜发生了从< br>bilayer
（双层膜）结构
向
micelle
（微囊）结构的相变 化所导致。由于质粒和细菌染色体的拓扑结
构不同，变性时前者尽管两条链分离，却仍旧缠绕在一起不分 开；但后者
完全变性分甚至显现断裂。因此，在裂解细菌时要注意：

第一，时刻不能 过长，因为在如此的碱性条件下
DNA
片断会慢慢断
裂；

第二，混合必须轻柔，不然
DNA
也会断裂。

1% SDS
（十二烷基磺酸钠）
：是一种阴离子表面活性剂，它既能使细
菌细胞裂解，又能使一些蛋白质 变性。


12.
这一步的
K
置换了
SDS（十二烷基磺酸钠）中的
Na
，得到
PDS
（十二烷基磺酸钾）沉淀；< br>SDS
易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合
一个
SDS
分子，钾钠 离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质
也沉淀了，同时基因组
DNA
也被
PDS
共沉淀。当加入
pH4.8
的酸性乙酸
钾降低溶液
p H
值，使溶液
pH
值复原较低的近中性水平常，

质粒的两条
小分子单链可迅速复性复原双链结构，然而主染色体
DNA
则难以复性。

SDS
遇到钾离子后变成十二烷基硫酸钾（
potassium dodecylsulfate, PD
S
）
，而
PDS
是不溶于水 的，而高浓度的盐使得沉淀更完全。
SDS
极易和蛋
白质结合，平均两个氨基酸上结合 一个
SDS
分子，钾钠离子置换所产生的
大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。< br>
同时，尽管
SDS
并不与
DNA
分子结合，由于大肠杆菌的 基因组
DNA
专门长，专门容易和变性的蛋白质缠绕在一起。在离心时，大部分主染色
体与细胞碎片，变性蛋白质等缠绕一起被沉淀，而复性的质粒
DNA
以可
溶性状态留在 上清夜中。

13.
所谓星活性又称
Star
活性。是指由于反应 条件不同而产生的切断
与原先认识序列不同的位点的现象，也确实是讲产生
Star
活 性后，不但能
够切断特异性的识别位点，还能够切断非特异性的位点。产生
Star
活 性的
结果是酶切条带增多。



因此讲
Star
活性与粘端变平端没关系。另外，
Star
活性除了与酶本身的性质有关外，与甘油浓度，pH
值及离子浓度有
关。



一样正规厂家生产的限 制酶出厂前都做有关的检测，
buffer
体系
也都做了相应的考虑。因此正常情形下 酶切，能够先不必考虑
Star
活性的
咨询题。


一旦显现底物
DNA
不行切断，需要增加酶量或延长反应时
刻时，如果使用的是易 产生
StaR
活性的限制酶切，一样优先考虑增加酶
量，而不是延长反应时刻，换句话 讲，延长时刻比增加酶量更易产生
Star
活性。



另 外，实际上几乎所有的限制性内切酶都可能产生
Star
活性。
但目前
Sta r
活性对实际实验室操作过程中的阻碍并不太大，能够先不考
虑。一样来讲，限制性内切存在严 格的识别在序列特异性，但某些条件改
变，会使其对识别序列特异性的放宽，而导致在
DNA< br>内产生附加切割，
限制性内切酶表现的这种活性称为星活性，或第二活性，在名称右上角加
一星号表示。

产生星活性的条件

①甘油浓度

②离子强度

高盐缓冲液酶降低盐

③
pH
值
7.5
～
8
．
5
产生

④有机溶剂
DMSO(
二甲亚砜
)1
～
2%(V/V)


⑤二价阳离子
Mn2+
代替
Mg2+


⑥酶与
DNA
的比例


酶与
DNA
比为
(50U
／μ
g)
产生星活性。为了防止星活性的显现，
所有 限制性内切酶反应在标准条件下
(
专门是
pH
、离子强度、二价离子浓
度的条件下
)
进行。


某些限制性内叨酶诱导产生星活性的反应条件




酶

诱导星活性条件



AvaI A,B,D


EcoRI A,B,D,E,F


Hae
Ⅲ
B,D


HhaI B,D,G


BamHI A,B,C,D,E,H










A
．乙二醇
(45
％
)
；
B .
甘油
(11
～
20
％
)
；
C.
乙醇
(12
％
)
；

D
．高酶：
DNA< br>比值
()25U
／μ
g)
；
E
．
Mn2+< br>代替
Mg2+
；

F
．
pH8
．
5
；
G
．
DMSO(8
％
)
；
H
． 无
NaCl

14.
同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种 酶同时作
用的最佳缓冲液是专门重要的一步。
NEB
每一种酶都随酶提供相应的最佳< br>NEBuffer
，以保证
100%
的酶活性。
NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲
液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的讲明书。能
在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非
最佳缓冲液条件下的切 割速率会减缓，因此使用时可按照每种酶在非最优
缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时刻。要保证 双酶切实验的高
效、准确，就要选择合适的通用
buffer
。如此就能幸免质粒和基 因没有切
动或者被切散。常用的几家内切酶公司有
MBI
、
NEB
、
Promega
、
Roch
e
、
Takara
， 要查找双酶切体系的通用
buffer
，最好到出品该内切酶的公司
网站上查询。
15.
缓冲液在电泳过程中的一个作用是坚持合适的
pH
。电泳时正 极与
负极都会发生电解反应，正极发生的是氧化反应（
4OH--4e->2H2O+O2)< br>，
负极发生的是还原反应（
4H++4e->2H2)
，长时刻的电泳将使正极 变酸，负
极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，是溶液两极的
pH
保持差不多不变。


电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性，以利于< br>DNA
分子的迁移，例如，一样电泳缓冲液中应含有
0.01-0.04mol/L的
Na+
离
子，
Na+
离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时 就会造成过大的电流使
胶发热甚至熔化。


电泳缓冲液还有一个组分是EDTA
，加入浓度为
1-2mmol/L
，目的是
螯合
Mg2 +
等离子，防止电泳时激活
DNA
酶，此外还可防止
Mg2+
离子与
核酸生成沉淀。

16.

17.
关于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在
0.5
～
2
％之间，低浓度的用来
进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低 浓度胶易碎，
小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决方法。注意高浓度的胶可能使分子
大小相近 的
DNA
带不易辨论，造成条带缺失现象。孔径大的琼脂糖。

19.
⑴、细胞的生长状态和密度

最好从
-70
℃或
-20℃甘油储存的菌种中直截了当转接用于制备感受态
细胞的菌液。不要用差不多过多次转接，及贮存在
4
℃的培养菌液。细胞
生长密度以每毫升培养液中的细胞数在
5
×< br>107
个左右为佳。即应用对数
期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的
OD600
操纵。对
TG1
菌
株，
OD600
为
0
．
5
时，细胞密度在
5
×
107
个
/ml
左右。
（应注意
OD600
值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转
化率下降。此外，受体细胞一样应是限制
-
修饰系统缺 陷的突变株，即不含
限制性内切酶和甲基化酶的突变株。同时受体细胞还应与所转化的载体性
质 相匹配。

⑵、质粒
DNA
的质量和浓度

用于转化的质粒
DNA
应要紧是超螺旋态的，转化率与外源
DNA
的浓
度在一定范畴 内成正比，但当加入的外源
DNA
的量过多或体积过大时，
则会使转化率下降。一样地 ，
DNA
溶液的体积不应超过感受态细胞体积的
5%
，
1ng
的
cccDNA
即可使
50ul
的感受态细胞达到饱和。关于以质粒为载< br>体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于
30kb
的重
组质 粒将专门难进行转化。此外，重组
DNA
分子的构型与转化效率也紧
密有关，环状重组 质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高
10~100
倍，因此重组
DNA
大都构成环状双螺旋分子。

⑶、试剂的质量

所用的
CaCl2
等试剂均需是最高纯度的，并用最纯洁的水配制，最好
分装储存于
4
℃。
⑷、防止杂菌和杂
DNA
的污染

整个操作过程均应在无菌条 件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪
头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且 注意防止
被其它试剂、
DNA
酶或杂
DNA
所污染，否则均会阻碍转 化效率或杂
DN
A
的转入。

⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会
降低。

20. TAE
是
Tris-
乙酸，缓冲容量小，然而溶解度大，易于储存

TBE
是
Tris-
硼酸，缓冲容量大，然而溶解度小，不易长期储存，易产
生沉淀


TAE
与
TBE
的区别

第一要明白
TAE
與
TBE
緩衝溶液的成份如下：

50x TAE Buffer (Tris-Acetate-EDTA)

242 gm Tris base

57.1 ml Acetic acid 100ml

0.5M EDTA