武汉妇产医院质粒DNA提取纯化及验证

2021年2月2日发(作者：注射隆鼻副作用)





山东大学实验报告





2012
年
9
月
26
日




姓名













系年级

10
级生命基地



组别








同组者









科目

分子生物学实验




题目




质粒
DNA
提取、纯化和电泳检测








学号





【实验目的】

1
、掌握碱变性提取质粒
DNA
法的原理、过程及各种试剂的作用。

2
、掌握凝胶电泳对
DNA
分离纯化的原理和方法。

【实验原理】

1
、提取、纯化质粒
DNA
（碱变性提取法）

提取和纯化 质粒
DNA
的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、
羟基磷灰石柱层析法 、
EB
一氯化铯密度梯度离心法和
Wizard
法等。其中，碱变
性 提取法最为经典和常用，
适于不同量质粒
DNA
的提取。
该方法操作简单，< br>易于
操作，一般实验室均可进行。提取的质粒
DNA
纯度高，可直接用于酶切、 序列测
定及分析。
碱变性提取质粒
DNA
一般包括三个基本步骤：
培 养细菌细胞以扩增质
粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒
DNA
。

在细菌细胞中，
染色体
DNA
以双螺旋结构存在，
质粒
DNA以共价闭合环状形
式存在。
细胞破碎后，
染色体
DNA
和质粒< br>DNA
均被释放出来，
但是两者变性与复
性所依赖的溶液
pH
值不同。
在
pH
值高达
12
．
0
的碱性溶液中，< br>染色体
DNA
的氢
键断裂，
双螺旋结构解开而变性；
共价闭合 环状质粒
DNA
的大部分氢键断裂，
但
两条互补链不完全分离。
当用
pH
值
4
．
6
的
KAc(
或
Na Ac)
高盐溶液调节碱性溶液
至中性时，
变性的质粒
DNA
可恢复原 来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液
中；但染色体
DNA
不能复性，而是与不稳 定的大分子
RNA
、蛋白质一
SDS
复合物
等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心，
与复性的溶于溶
液的质粒
DN A
分离。溶于上清液的质粒
DNA
，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚
而形成 沉淀。由于
DNA
与
RNA
性质类似，乙醇沉淀
DNA
的同 时，也伴随着
RNA
沉淀，可利用
RNase
A
将
RNA
降解。质粒
DNA
溶液中的
RNase
A
以及一些可溶性
蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒
DNA
。

2
、琼脂糖凝胶电泳

电泳
（
electrophoresis)
是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向





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分子生物学实验




题目




质粒
DNA
提取、纯化和电泳检测








学号





移动的现象。
各种生物大分子在一定条件下，
可以解离成带电荷 的离子，
在电场
中会向相反的电极移动。
凝胶是支持电泳介质，
它具有分子筛 效应。
含有电解液
的凝胶在电场中，
其中的电离子会发生移动，
移动的速度可 因电离子的大小、
形
态及电荷量的不同而有差异。
利用移动速度差异，
就可以 区别各种大小不同的分
子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化
DNA
片段，是分 子生物学的核心技
术之一。

凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广 。此外，凝胶中
DNA
的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭
(EB)
或
SYBR
Gold
染色直接观
察到，
甚至含量少至
20
Pg
的双链
DNA
在紫外激发下也能直接检测到。
需要的话，
这些分离的
DNA
条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。

分 子生物学实验中，
常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。
这两种凝
胶能灌制成各 种形状、
大小和孔径，
也能以许多不同的构型和方位进行电泳。
琼
脂糖凝胶电 泳易于操作，
适用于核酸电泳，
测定
DNA
的相对分子质量，
分离经 限
制酶水解的
DNA
片段，进一步纯化
DNA
等。琼脂糖凝胶电泳是 一种常用的方法。
在溶液中，由于核酸有磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。
DNA在琼脂糖
凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面
6
个因素：

1 )
样品
DNA
分子的大小：
电泳时，
线性双螺旋
DNA分子是以头尾位向前迁移
的，
其迁移速度与相对分子质量
(
所含碱基)
的对数值成反比，
这是因为大分子有
更大的摩擦阻力。

2) DNA
分子的构象：相对分子质量相同而构象不同的
DNA
分子，其迁移速率
不同。
在抽提质粒
DNA
过程中，
由于各种因素的影响，
使超螺旋的 共价闭合环状
结构的质粒
DNA(covalently closed circular DNA
，
cccDNA)
的一条链断裂，变
成开环
DNA(open circle DNA
，
oeDNA)
分子，如果两条链发生断裂，就转变为线
状
DNA(1iner DNA
，
L DNA)
分子。这三种构型的分子有 不同的迁移率。一般情况
下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。

3)
琼脂糖浓度：
琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，
一定大小的
DN A
片段在不
同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，




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题目




质粒
DNA
提取、纯化和电泳检测








学号





DNA
电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。
4)
电泳所用电场：
低电压条件下，
线性
DNA
片段的迁移速率 与所用电压成正
比，电压越高，带电颗粒泳动越快，但随着电场强度的增加，不同长度
DNA< br>泳动
的增加程度不同，
因此凝胶电泳分离
DNA
的有效范围随着电压上 升而减少。
为了
获得
DNA
片段的最佳分离效果，电场强度应小于
5 V
／
cm
。

5)
缓冲液：
缓冲液的组成和离子强 度直接影响迁移率。
当电泳液为去离子水
(
如不慎误用去离子水配制凝胶
)< br>，溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，
DNA
几乎不移动；而在高离子强度下
(
如错用
10
×电泳缓冲液
)
，导电性极高，带电
颗粒泳 动很快，
产生大量的热，
有时甚至熔化凝胶或使
DNA
变性。
电泳时 常用的
缓冲液有乙酸盐（
TAE
）
、硼酸盐（
TBE)
和磷 酸盐（
TPE
）几种不同的缓冲液，通
常配制成
10
×或
5
×的浓度母液保存于室温下，用时稀释至工作浓度。
TAE
缓冲
液缓冲能力弱 ，长时间电泳缓冲能力逐渐丧失（阳极变碱性，阴极变酸性）
，长
时间电泳需要更换缓冲液。< br>TAE
缓冲液可以分离数
KB
长度的
DNA
，在精致
DNA
片段以及染色体
DNA
进行杂交时经常使用。

6)
温度：琼脂糖凝胶电泳时，不同大小
DNA
片段的相对电泳迁移率在
4
～< br>30
℃内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于
0
．
5
％时，凝胶很脆弱，最好在
4
℃下电泳以增加凝胶强度。

【实验仪器、材料及试剂】

1
、仪器和材料

接种环，< br>培养皿，
酒精灯，
恒温振荡培养箱，
高速冷冻离心机，
漩涡振荡器，< br>微量移液器及多型号枪头，微波炉，电泳仪等

菌体：


DH5
α
受体菌，具有
Amp
r
标记的质粒pUC19
。

Maker:
λ
/
Hind
III DNA Maker DL2000 DNA Maker
点样对照组：
pUC19/
Hind
II
双链线性
DNA PUC19
（商品）

λ
DNA
2
、实验试剂

LB
培养基，抗生素（ 氨苄青霉素）
，溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，
3mol/L
NaAc





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题目




质粒
DNA
提取、纯化和电泳检测








学号





溶液，预冷无水乙醇，
70%
乙醇溶液，
RNase
A
母液，
TE
缓冲液，饱和酚，氯仿
/
异戊醇混合液，酚< br>/
氯仿
/
异戊醇
(PCI)
混合液，
TAE
电泳缓冲液（
10
×）
，溴化乙
锭（
EB)
，上样缓冲液（
6
×）
。

溶液Ⅰ：
50mM
葡萄糖，
25mM Tris-HCl(pH 8.0)
，
10mM EDTA(pH 8.0
）
。
(1M
Tris-HCl
，
12.5ml
pH
8.0
；
0.5M
EDTA
10ml
pH
8.0
，葡萄糖
4.730g
，加
ddH2O
至
500ml
。在
121
℃高压灭菌
15min
，贮存于
4
℃
)
。

溶液Ⅱ：
0.2M NaOH
，
1% SDS
。
(
使用前用
10M
的< br>NaOH
和
10%
的
SDS
母液配
置，防止
NaOH
吸收空气中的
H2O
和
CO2
而减弱了碱性）
。< br>
溶液Ⅲ：
5M
醋酸钾（
KAc
）缓冲液
60ml< br>，冰醋酸
11.5ml
，重蒸水
28.5ml
，
溶液中浓度< br>K
+
3M,Ac
-
5M
。

【实验步骤】

1
、扩增质粒（菌体培养）

1
）在
LB
平板上划线培养具有
Amp
r
标记的

DH5
α
菌，
37
℃恒温倒置
培养
16-18hr
；
之后，
挑取单菌落，
接种于
20ml
LB
液体 培养基
（含
Amp
r
80ug/ml
）
中，
37< br>℃，
220rpm
振荡培养过夜
12-14hr
；再转接一次，进行< br>50
或
100
倍稀释，
同样
37
℃，
220 rpm
振荡培养
4-6hr
。

2
）
对
5 0mL
的离心管称重
（记为
m
1
）
，
取菌液
30ml
配平，
6000rpm
离心
5min
，
弃去上清 液；加入
5ml
溶液Ⅰ混匀，
6000rpm
离心
5min,
弃去上清液。取离心管
称重（记为
m
2
)
，可测得菌体重量
W=m
2
-m
1
。

2
、提取质粒

1
）向离心管中加入溶液Ⅰ（
1.0ml/100mg
菌体）
，漩 涡混匀后，冰浴
5min
；


向离心管中加入溶液Ⅱ
（
2.0ml/100mg
菌体）
，
轻柔颠倒混匀后，
冰浴
5min
；


向离心管中加入溶液Ⅲ
（
1.5m l/100mg
菌体）
，
轻柔颠倒混匀后，
冰浴
5min
；

离心管配平，
12000rpm
离心
15min,
取上清 至新
50ml
离心管（记体积为
v
1
)
2
）加 入
2v
1
冰乙醇，颠倒混匀，
-20
℃保存
30min，
12000rpm
离心
15min,
弃上
清液
,将离心管倒置于纸巾上，以使所有液体流出。向沉淀中加入
5mL70%
乙醇进





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2012
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9
月
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姓名













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级生命基地



组别








同组者









科目

分子生物学实验




题目




质粒
DNA
提取、纯化和电泳检测








学号





行洗涤，
12000rpm
离心
2min,
弃 去上清液，重复洗涤一次；

37
℃下保存
5min,
至离 心管内干燥，加入
1mlTE
缓冲液溶解，得粗提物，将
粗提物转移至新
EP
管，加入
100ugRNase A
（
10ug/ul),
将
EP
管放置于
37
℃下，
保温
1-2
小时。

3
、纯化质粒

1
）将提取物等分为
500ul
置于
EP
管中，加等体积酚液，混匀后，
12000r
离
心
5min,
将上清液转移至新
EP
管；加入等体积酚
/
氯仿
/
异戊醇
(PCI)
混合液，混
匀后，
12000rpm
离心
5min,
转上清至新
EP
管；加入等体积氯仿
/
异戊 醇混合液，
混匀后，
12000rpm
离心
5min,
将上清液转移 至新
EP
管；

2
）
加入
1/10
体积的
3mol/L
NaAc
，
混匀后，
加入
2
倍体积
（包括上清液和
1/10
体积的
NaAc)
的冰乙醇，颠倒混匀，
-20
℃保存
30min< br>，
12000rpm
离心
15min,
弃
去上清液；加入5mL70%
乙醇进行洗涤，
12000rpm
离心
2min,
弃去上清液，重复
洗涤一次；

37
℃下保存
5min,
至沉淀干燥
,
每管加入
25ul TE
溶液
,
温和振荡几秒钟，至
沉淀溶解。将
2
管整合到一 管，得到
50ul
质粒
DNA
组，放置
-20
℃下保存。< br>
4
、凝胶电泳分离质粒

1
）制胶：
1% < br>琼脂糖凝胶：称取
0.4g
琼脂糖于
300ml
三角烧瓶中，加
40ml
1
×
TAE
，
微波炉加热至完全溶化，
冷却至
60
℃左右，
三角瓶放在手面可坚持
1min
即可，缓缓倒入架有梳 子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却
30min
以上，轻
轻拔出梳子，放入电泳槽 中（电泳缓冲液
1
×
TAE
）
，即可上样。

2
）取
3.0
μ
l
纯化
DNA
加入
1.0
μ
l
上样缓冲液，混合，进行点样。点样完毕
后，
100V
，
200mA
条件下电泳
30min
。电泳完毕后，进行
EB
染色，用凝胶成像仪
拍照，得到实验结果。

【注意事项】

1
、在接菌时，注意无菌操作，物品应在酒精灯火焰上方无菌区域内。将挑