怎么减肥不反弹实验五 质粒DNA的制备

2021年2月2日发(作者：热玛吉紧肤价格)
实验五

质粒
DNA
的制备

【实验目的】

1.
了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用；

2.
掌握质粒
DNA
分离和纯化的原理；

3.
学习碱裂解法和煮沸法分离质粒
DNA
的方法。


【实验原理】

质粒是细菌内的共生型遗传因子，
它能在细菌中垂直遗传并且 赋予宿主细胞特定的表型。
质粒载体是
在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的 。与天然质粒相比
,
质粒载体通常带有一个
或一个以上的选择性标记基因
(< br>如抗生素抗性基因
)
和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点
的多克隆 位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多
质粒载体带有 一些多用途的辅助序列，
这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、
产生用于
序列测定的单链
DNA
、体外转录外源
DNA
序列、鉴定片段的插入方向、 外源基因的大量表达等。一
个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：
（
1
） 分子量小、多拷贝、松驰控制型；
（
2
）具有多种常用
的限制性内切酶的单个 酶切位点；
（
3
）
能插入较大的外源
DNA
片段；
（
4
）
具有容易操作的检测表型。
常用的质粒载体大小一般在
1k b
至
10kb
之间，
如
pBR322
、
pUC
系列、
pGEM
系列和
pBluescript
（简
称< br>pBS
）等。经过改造的基因工程质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介，这种基 因
的运载工具在基因工程中具有极广泛的用途，
而质粒的分离与提取则是基因工程最常用、最基本的实
验技术。


一般分离质粒
DNA
的方法都 包括
3
个步骤：
①培养细菌，
使质粒
DNA
大量扩增；②收集和裂解细菌；
③分离和纯化质粒
DNA
。分离制备质粒
DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、
SDS
法和羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株的类型、
质粒分子大小、
碱基组成和结构
等特点以 及质粒
DNA
的用途选择不同的方法。
本实验介绍最常用的碱裂解法和煮沸法提取质粒
DNA
。


1.
碱变性法








碱变性法提取质粒
DNA< br>是基于染色体
DNA
与质粒
DNA
的变性和复性的差异而达到分离的目
的。在
pH
值高达
12.6
的碱性环境中，染色体的线性
D NA
的氢键断裂，双螺旋结构解开而被变性；
共价闭环质粒
DNA
的大部分氢 键也断裂，但两条互补链不会完全分离，仍会紧密地结合在一起。用
pH4.8
的
KA c
或
NaAc
高盐缓冲液调节其
pH
值到中性时，因为共价闭合环状 的质粒
DNA
的两条互补
链仍保持在一起，因此可以迅速复性；而线性的染色体
DNA
的两条互补链彼此已完全分开，不能复
性，它们相互缠绕形成不溶性网状物，而复性的 质粒
DNA
恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离
心，染色体
DNA
与不稳定的大分子
RNA
、蛋白质
-SDS
复合物等一起沉淀下来而被除去 ，用酚
-
氯仿抽
提纯化上清液中的质粒
DNA
，然后用乙醇或异丙醇 将溶于上清液中的质粒
DNA
沉淀。


2.
煮沸法









细胞用含有
TritonX
－
100
的缓冲液 处理，溶解细胞膜。用溶菌酶酶解细菌细胞，然后在高温
条件下，使细胞裂解，破坏细菌细胞壁，有助于 解开
DNA
链的碱基对，并使蛋白质和染色体
DNA
变
性。而闭环质 粒
DNA
配对虽被破坏，但双链彼此不分开，当温度下降时恢复成超螺旋。变性蛋白带
着染色体
DNA
一起沉淀下来，质粒
DNA
仍留在上清液中。离心后的上清液 再用异丙醇或乙醇处理，
沉淀出质粒
DNA
。













以上两种制备方法的实验过程中，由于细菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用，染色体
DN A
容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒
DNA
共同存在，
因此，采用乙醇沉淀法得到的
DNA
除含有质粒
DNA
外，还可能有少部分染色 体
DNA
和
RNA
，必要时可进一步纯化。









提取的质粒
DNA
中会含有
RNA
，但
RNA
一般并不干扰进一步实验，如限制性内切酶消化，
亚克隆及连接反应等，因此不必除去。


【试剂与器材】

（一）菌种和培养基

1.
大肠杆菌
DH5
α
（含质粒
pT-GFP
，该 质粒为
T
载体联上了绿色荧光蛋白
GFP
基因的重组质粒）
。


液体培养基
(Luria-Bertani)
：
称取蛋白胨
(Tryptone)10 g
，
酵母提取物
(Yeast extract) 5 g
，
NaCl 10 g
，
溶于
800mL
去离子水中，用
NaOH
调
pH
至
7.2
，加去离子水至总体积
1 L
。分装于
150
mL
三角瓶中，
每瓶
50 mL
，置高压蒸气锅以
1.034
×
105Pa
，
121
℃灭 菌
20
分钟。

3.
氨苄青霉素
(Ampicillin, Amp)
母液：用无菌水配成

10 mg/mL
水溶液，过滤除菌，分装成 小份存于灭
菌有盖离心管中，
-20
℃保存备用，不宜反复冻溶。


（二）试剂

1.
溶液
I
：
50 mmol/L
葡萄糖，
25 mmol/L (pH8.0)
，
10mmol/L EDTA (pH8.0)
。高压灭菌
15min
，储
存于
4
℃冰箱。

2.
溶液Ⅱ：
0.2 mol/L NaOH
（临用前用
10mol/L NaOH
母液稀释）
，
1
％

SDS
（从
10% SDS
母液中稀释，
SDS
母液可室温保存）
，现配现用。


3.
溶液
III
：
5 mol/L KAc 60mL
，冰醋酸
11.5mL
，
H2O 28.5mL
，高压灭菌，
4
℃冰箱保存。溶液终浓度为
:
K+ 3mol/L, Ac
ˉ

5mol/L
。

4.3 mol/L
醋酸钠

(pH5.2)
：
800 mL
水中溶解
408.1g NaAc
?
3H2O
，用冰醋酸调pH
至
5.2
，加水定容至
100mL
，分装后高压灭菌，储存 于
4
℃冰箱。


缓冲液：
0.1mol/L NaCl
，
10mmol/L Tris
?
Cl(pH8.0)
，
1mmol/L EDTA (pH8.0)
。


：
0.1 mol/L NaCl
，
10mmol/L Tris
?
Cl(pH8.0)
，
1mmol/L EDTA (pH8.0)
，

5% Triton
X-100
。


缓冲液：
10 mmo/L Tris
?
Cl (pH8.0)
，
1 mmol/L EDTA (pH8.0)
。高压灭菌后储存于
4
℃冰箱中。


酶A
母液：将
RNA
酶
A
溶于
10mmol/L Tris
?
Cl(pH7.5)
，
15mmol/L NaCl
中， 配成
10mg/mL
的溶
液，
于
100
℃加热
15 min
，
使残留的
DNA
酶失活。
冷却后用
1.5mL Eppendorf
管分装成小份保存于
-20
℃。


9.
溶菌酶（
10mg/ml
）
：用
10mmol/L , PH8.0,
新鲜配制。


饱和酚（
1
）

11.
酚
:
氯仿
:
异戊醇

(25:24:1)
：

12.
氯仿：异戊醇（
24:1< br>）
：按氯仿
:
异戊醇＝
24:1
体积比加入异戊醇（
2
）
。氯仿可使蛋白变性并有助于
水相与有机相的分开，异戊醇则可消除抽提过程中出 现的泡沫。

13.
电泳所用试剂：

（
1
）

TBE
缓冲液

(5
×
)
：称取

Tris 54g
，硼酸
27.5g
，并加入

0.5M EDTA (pH8.0)
20mL
，定溶至
1000mL
。

（
2
）上样缓冲液

(6
×
)
：
0.25%
溴酚蓝，
40% (w/v)
蔗糖水溶液。

14.
异丙醇

15.70
％乙醇


（二）设备

超净工作台，微量取液器
(20
μ
L, 200
μ
L, 1 000
μ
L)
，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒
器
(
灭菌锅
)
，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。


【操作方法】

（一）小量制备

碱变性法：

1.
将含有质粒
pGFPuv
的
DH5
α
菌种划 线接种在
LB
固体培养基
（含有
100
μ
g/mL Am p
）
（
3
）
上，
37
℃
培养
12 -24
小时（
4
）
。用无菌牙签挑取单菌落接种到
5mL
LB
液体培养基
(
含有
100
μ
g/mL Amp)
中，
37
℃振荡培养
14~16
小时。

2.
取
1.5 mL
培养液加入
1.5 mL
离心管中，室温
12, 000 r/min
离心
1
分钟收集菌体< br>(
视菌体量多少，可
重复此步
)
。

3.
加入
100
μ
L
预冷的溶液Ⅰ涡旋振荡悬浮菌体（
5
）
。


4.
加入新配制的溶液Ⅱ
200
μ
L
，
轻缓上下颠倒离心
5
次，
至溶液澄清
(
千万不要振荡
)，
冰浴
5
分钟
（
6
）
。

5 .
立即加入用冰预冷的
150
μ
L
溶液
III
，轻 柔振荡
5~10
次（
7
）
，冰浴
5
分钟（
8
）
，
12, 000 r/min
离心
5min
。

6.
取上清移入干净
Eppendorf
管中，加入等体积的酚
:
氯仿
:
异戊醇

(25:24:1)
，剧烈振荡
20
秒。室温下
12,000 r/min
离心
10
分钟，可见溶液分三层，上层为质粒
DNA
溶液，中层为变性的蛋白层，下层为
有机相。

7.
取上清（
6）
，加入
400
μ
L
氯仿
:
异戊醇
( 24:1)
，剧烈振荡
20
秒。
12,000r/min
离心
10
分钟。
（选做）

8.
取上清，加入2~2.5
倍体积无水乙醇振荡混匀，沉淀
DNA
，
-20
℃放 置
10min
（
7
）
。
（或者加
1
倍异< br>丙醇，室温静置
10min
）
，
12,000rpm
离心
10
分钟。

9.
去上清，加入
200
μ
L 70%
乙醇（
8< br>）
，
12000g
，
2
分钟。洗涤沉淀两次以去盐。

10.
将
Eppendorf
管倒置于一张纸巾上，使液体流出，然后短暂离 心，用移液器小心取出残液，这一步
操作要格外小心，有时沉淀块贴壁不紧，放离心管于超净工作台蒸发 痕迹乙醇。
（除去上清的简便方
法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头 接触液面。当液体从管中吸出时，尽
可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的 液滴）
。

11.
将沉淀溶于
30
μ
L TE
缓冲液
(pH8.0
，
含
20
μ
g /mL RNaseA)
中
（
9
）
，
储于
-20
℃ 冰箱中。
如直接酶切，
可将沉淀溶于
30~50
μ
L ddH2O
（含
20
μ
g /mL RNaseA
）
。


12.
利用比色法测定质粒
DNA
在
260 nm
和
280 nm
下的光吸收值并计算样品浓度。

13.
用
1%
琼脂糖凝胶电泳观察质粒
DNA
的纯度和条带情况。



煮沸法


1.
取
1.5ml 培养菌体（
1
）置于离心管中
,10000
ｇ离心
1
分 钟。

2.
弃上清（
2
）
，将管倒置于卫生纸上几分钟，使 液体流尽。

3.
将菌体沉淀悬浮于
350ul STET
溶液中
,
涡旋混匀。

4.
加入
25ul
新配制的溶菌酶溶液
(10mg/ml)
（
3
）
,
涡旋振荡
3
秒钟混匀。
（溶菌酶溶液
PH
值不能低
于
8.0
，否则溶菌酶就不能有效发挥作用。
）

5.
将 离心管放入沸水浴中
,
时间恰为
40
秒，
12000g
，离 心
10
分钟。

6.
吸出上清移至另一个离心管，
或直接用 消毒牙签取出沉淀物，
在上清中加入
40ul 5mol/L NaAc
（
PH5.2
）
和
420ul
异丙醇，振荡混匀，室温放置
5
分钟。

7.12000g
，
4
℃离心
5
分钟，将
Eppendorf
管倒置于一张纸 巾上，使液体流出，然后短暂离心，用移液
器小心取出残液，
这一步操作要格外小心，
有时沉淀块贴壁不紧，
放离心管于超净工作台蒸发痕迹乙
醇或室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可 见的液体（
2
－
5
）分钟。

8.
弃上清，

加入
1ml70
％乙醇，
1200 0g
，
4
℃离心
2
分钟。按步骤
7
回收核酸沉淀。

9.
加入
50ul TE
（
PH8.0
）
（含无
DNA
酶的
RNA
酶

20ug/ml
）
，溶解
DNA
，稍加振荡，储存于－
20
℃。













（二）大量制备


碱变性法：

1.
从平板上挑选一个单菌落，接种到
50mL
培养基，
37
℃过夜培养
14~16
小时。

2.
将培养物转入
50mL
离心管，
4,800r/min 4
℃离心
10
分钟。

3.
沉淀用
10mL STE
洗涤，涡旋打匀，

4,800r/min 4
℃离心
10
分钟。

4.
加入
3mL
溶 液
I
，涡旋，冰浴
5
分钟。

5.
加入
6 mL
溶液Ⅱ
(
现配
)
，轻柔颠倒数次直至溶液澄清，保持冰浴
5
分钟。

6.
马上加入溶液Ⅲ

4.5mL
， 轻柔颠倒
5~10
次，得到白色沉淀，冰浴
3
－
5
分钟。< br>
7.4,800r/min 4
℃离心
20
分钟，取上清，加入0.6
倍体积异丙醇，室温放置
10
分钟，沉淀
DNA
。

8.4,800r/min
室温离心

10
分钟，去上清，加入
75%
乙醇，洗涤沉淀。

9.4,800r/min
离心

10
分钟，去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。

10.
加入
1.5mL TE
溶液，溶解沉淀，转入
7mL
离心管。

11.
加入等体积
5mol/L LiCl (
预冷
)
，颠 倒混匀，冰浴
10
分钟，沉淀大分子
RNA
。

12.10,000r/min 4
℃

离心
10
分钟，取 上清，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置
10
分钟。