三围指什么DNA电泳实验报告 杨家庆

2021年2月2日发(作者：塞跳蛋)

浙江农林大学



实验室开放项目

DNA
和蛋白质的电泳技术





姓

名：杨家庆


班

级：测绘工程
151
班


学

号：
2

指导老师：杨仙玉




完成时间：
2016
年
11
月
23
日





一、实验名称：
DNA
的电泳技术

二、实验目的：琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习
DNA
琼脂
糖凝胶电泳的使用技术 ，
掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。

三、
实验原理：
琼脂糖 凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定
DNA
、
RNA
分
子
混< br>合
物
的
方
法
，
这
种
电
泳< br>方
法
以
琼脂凝胶作为支持物，
利用
DNA
分子
在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
DNA
分
子在高于其等 电点的溶液中带负电，
在电场中向阳极移动。
在一定的
电场强度下，
DNA< br>分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的
大小和构型是主要的影响因素。
DNA
分子的迁移速度与其相对分子量
成反比。不同构型的
DNA
分子的迁移速度不 同。

四、实验器材：

仪器：
制胶模具、电泳槽、电泳仪、烧杯、 锥形瓶、移液枪、手套、
微波炉、凝胶成像仪、分析天平、钥匙、离心机、紫外线透射仪、干
式 恒温器等。

试剂：
琼脂糖（白色粉末）
、
TAE
缓冲液、
EB
（溴化乙锭
-
致癌剂，
操作中要严格戴手套）
；

五、实验步骤：

（一）
DNA
电泳实验

1.
模板胶的制作：

①
.
称取
1g
琼脂 糖加入盛有
100mL
的
1*TAE
溶液中，
混合均匀后用微
波炉加热至沸腾，加热
2-3
次，每次沸腾之后取出摇匀，直至混合均
匀；



②
.
待溶液冷却至
40-50
℃时，倒入制胶 模具内（注意要快速倒入，
以防倒入的过程中溶液凝胶）
，凝固后，上
DNA
样品；

③
.
上样后，
将模具移入电泳槽，
将样品端上到负 极，
通电，
恒压
120V
，
25-30min
；

④
.
将胶移入凝胶成像仪，用紫外光观察，拍照存档，保存图片；

⑤
.
清理实验相关物品，整理实验器材，实验结束。


凝胶回收：

①
.
称量凝胶重量，
按质量：
体积
=1:1
换算，
再按凝胶：
Buffer
G=1:3
加入
3
倍的
Buffer G
溶液放入干湿恒温机中加热融化；

②
.
将溶液转入
2m l
离心管中，离心
30s
（
13200rmp/min
）
；

③
.
在离心管中再加入
500
微升的
Buffer WS
溶液，离心
30s
；

④
.
加入
70 0
微升的
WG
溶液，离心
30s
；

⑤
.
离心结束后，
倒掉废液，
将空的离心管放入离心机空转
30s
或1min
，
将
DNA
中的残留液体甩干净；

⑥．离心 结束后，
将含有
DNA
的薄片快速取出（为防止剩余的酒精再
次挥发进入）< br>；

⑦
.
在放置
DNA
薄片的离心管中加入
20
微升的水（水要从中间加入，
打在
DNA
薄片上，待
DNA溶于水）
，静置
1min
，离心；

⑧．清理实验相关物品，整理实验器材，实验结束。

3.
凝胶回收后
DNA
片段的电泳：

①
.
将胶从凝胶成像仪中取出，在相对黑暗的条件下用紫外光照射，
看到清晰地六条条带之后，
将 相应的条带逐条切下
（切的时候尽可能


薄，每个条带的重量不要超过0.3g
）
，做凝胶回收，得到相应的
DNA
分子；

②．重复制胶过程，在得到的模具中重复上样过程，在第一个孔内上
标准
DNA
样品， 其余孔内加入相应波长
DNA
样品；

③
.
上样后，
将模具移入电泳槽，
将样品端上到负极，
通电，
恒压
120V
，< br>25-30min
；

④
.
将胶移入凝胶成像仪，用紫外光观察，拍照存档，保存图片；

⑤
.
清理实验相关物品，整理实验器材，实验结束。

（二）
PCR
（
Polymerase chain reaction,
聚合酶链式反应
）实验：

１、配置反应所需试剂：反应 体系为
20
微升，首先加入
14
微升水，
然后依次加入
2< br>微升
10*
Ｂ（
buffer
）
、
0.8
微 升
DNTPs
（四种脱氧核
苷酸混合物）
、１微升
cDNA
（模板
DNA
）
、１微升引物１、
1
微升引物
２（引物1
、２方向相反）
、以及
0.2
微升
Taq
（
DNA
聚合酶）
；

２、溶液配置好之后，对溶液溶液进行预变性处理，条件
95
℃，时
间
2-5min
；

３、预处理过后， 进行变性操作，条件
94
℃，时间
30
ｓ，之后，进
行退活，条件< br>58
℃时间
30s
，然后延长反应，
72
℃、
30< br>ｓ；

４、重复步骤３，共循环
35
次；

５、循环过程结束，在
72
℃下保存８
min
；

６、制作琼脂糖凝胶，将样品与５微升
loading buffer
溶液混合，
上样，进行电泳；

７、将胶移入凝胶成像仪，用紫外光观察，拍照存档，保存图片；



８、清理实验相关物品，整理实验器材，实验结束。

六、
实验结果：

标准
DNA
上样后成像为（如下左图）< br>：从上到下六条分带分别代表不
同大小的
DNA
分子片段，带的粗细表现该片段 的含量的多少，如图，
从上到下每个条带一次对应的
DNA
分子片段的大小为
:2000bp
、
1000bp
、
750bp
、
500bp
、
250bp
、
100bp
。凝胶回收后，各个不同片段
的 条带与
MARKER
带的对比成像为（如下右图）
，其中，最亮的条带对
应的
DNA
量是
150ng,
其余的均为
50ng

PCR
实验结果成图为


七、结果讨论
:
影响实验结果的因素有：

1.
实验过程中仪器操作不当；

2.
实验过程中液体漏加或加错；



3.
电泳时电场强度以及电泳液的导电性能的影响；

4.
实验中所需溶液不同浓度所带来的影响；

5.
上样时在注入样品的过程中没有成功注入；

6.
凝胶成像仪使用不当等。

八、实验感想和建议
:
1 .
通过一学期的实验，
我越发的明白实验操作对于结果的重要性。
实验操作可以说是实 验成功与否的关键部分，
可是马虎不得。
对于需
要团队合作的实验，
个人认为 要有强势的人员搭档，
不说是精通实验
操作规程，
最少也得知道实验的基本操作，掌握要做实验的操作方法，
这对于后续的实验无疑是与决定性作用的。
对于个人的实验能力 ，
关
键还是要看平时的积累，有些实验操作繁琐复杂，需要极大的耐心，
这些都应该是 逐渐培养起来的。

2.
通过这次实验的学习，使我学到了不少实用的知识
,
更重要的
是
,
做实验的过程
,
思考问题的方法
,< br>这与做其他的实验是通用的，加
强了我的动手能力，并且培养了我的独立思考能力，使我受益匪浅
.
3.
通过这次实验的学习，我学到了很多，得到了很多，有些是书
本上学 不到的，只有自己参与了，操作了，才会知道。也要感谢老师
对我们的照顾。