韩秀云真菌检测步骤(1)教学提纲

2021年1月31日发(作者：卵巢早衰能治好吗)
真菌检查步骤

1.
采集标本

浅部真菌的标本有毛发、皮 屑、甲屑、痂等，标本在分离前常先用
75%
的乙
醇消毒。深部真菌的标本可根据情况 取痰、尿液、粪便、脓液、口腔或阴道分泌物、血液、
脑脊液、各种穿刺液和活检组织，采集标本时应注 意无菌操作。


2.
检查方法

真菌检查的方法主要有：


（
1
）直接涂片：为最简单而 重要的诊断方法。取标本置玻片上，加一滴
10%KOH
溶液，
盖上盖玻片，在酒精灯 火焰上稍加热，待标本溶解，轻轻加压盖玻片使标本透明即可镜检。
可用于检查有无菌丝或孢子，但不能 确定菌种。


（
2
）墨汁涂片：用于检查隐球菌及其他有荚膜的孢 子。医学教育
|
网搜集整理方法是取一
小滴墨汁与标本（如脑脊液）混合，盖上盖玻片 后直接镜检。


（
3
）涂片或组织切片染色：涂片染色可更好地显 示真菌形态和结构。革兰染色适用于白念
珠菌、孢子丝菌等；瑞氏染色适用于组织胞浆菌；组织切片通常 用
PAS
染色，多数真菌可
被染成红色。


（
4
）培养检查：可提高真菌检出率，并能确定菌种。标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基
上，置室 温或
37
℃培养
1
～
3
周，必要时可行玻片小培养协助鉴定 。菌种鉴定常根据菌落
的形态及显微镜下形态判断，对某些真菌，有时尚需配合其他鉴别培养基、
生化反应、
分子
生物学方法确定。

四、真菌学检验的基本技术

（一）



直接镜检

是最简单也是最有用的实 验室诊断方法，常用的方法有：①氢氧化钾
/
复方氢氧化钾法：标
本置于载玻片上，< br>加一滴浮载液，
盖上盖玻片，
放置片刻或微加热，
即在火焰上快速通过
2
～
3
次，不应使其沸腾，以免结晶，然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用棉 拭或吸水
纸吸去周围溢液，置于显微镜下检查。检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。浮载液：
A.10%~20 %
的
KOH
。配方：氢氧化钾
10
～
20g
，蒸馏 水加至
100ml
，待氢氧化钾完全溶解后揺匀存放在塑
料瓶内，适用于皮屑、甲屑、 毛发、痂皮、痰、粪便、组织、耵聍等的检查。
B.
复方氢氧化
钾溶液配方：氢氧化钾 （
AR
）
10g
，二甲基亚砜（
AR
）
40ml,
甘油
50ml,
蒸馏水加至
100ml,
配制方法：将氢氧化钾先 加入
30ml
蒸馏水中溶解后，再依次加入
DMSO
、甘油揺匀后，用蒸馏水加到
100ml
，装入塑料瓶内。此配方的优点是：配方中加
DMSO
，能促进角质的溶解，有
甘油涂片不易干，不易制成氢氧化钾结晶，氢氧化钾的浓度相对低，腐蚀性亦 低，为进行大
面积普查或大批量采集标本作镜检带来了方便。②胶纸粘贴法：用
1cm×1.5 cm
的透明双面
胶带贴于取材部位数分钟后自取材部位揭下，撕去复带在上面的底板纸贴在载玻 片上，使原
贴在取材部位的一面暴露在上面，再进行革兰染色或过碘酸锡夫染色，在操作过程中应注意< br>双向胶带粘贴在载玻片上时不可贴反，
而且要充分展平，
否则影响观察。
③涂片 染色检查法：
在载玻片上滴
1
滴生理盐水，将所采集的标本均匀涂在载玻片上，自然干 燥后，火焰固定或
甲醇固定。再选择适当的染色方法，染色后，以高倍镜或油镜观察。

常见镜检染色方法有：①革兰染色。所有真菌、放线菌均为革兰染色阳性，被染成蓝黑色。
适用于酵母 菌、孢子丝菌、组织孢浆菌及诺卡菌、放线菌的感染。②乳酸酚棉蓝染色：用于
各种真菌培养物的镜检。 ③印度墨汁：用于检测脑脊液（
CSF
）中的新生隐球菌。④抗酸染
色：用于抗酸菌及 诺卡菌的诊断。⑤瑞氏染色：用于组织胞浆菌和马内菲青霉的检测。⑥过
碘酸锡夫染色（
PAS
）：用于体液渗出液和组织匀浆等。真菌胞壁中的多糖染色后呈红色，
细菌和中性细胞偶可呈假 阳性，但与真菌结构不同，不难区别。⑦嗜银染色（
GMS
）：真菌
可染成黑色，主要 用于测定组织内真菌。

（二）



真菌培养

从临床标本中对致病真菌进行培养，目的是为了进一步提高对病原体检出的阳性率，以弥补
直接 镜检的不足，
同时确定致病菌的种类。
真菌培养检查除需要一般细菌检验用到的器具外，
还应准备真菌专用的接种针、接种环、或接种钩（用铂丝或镍丝制成）、微型小铲、刀片、
针头等，< br>常规分离鉴定使用的培养基为沙氏葡萄糖琼脂
（
SDA
）
斜面培养基，
加
0.05%
氯霉素，
还有多种性质的培养基（见第二部分）以满足各种不同 的需要，可酌情选用接种的方法，根
据不同的临床标本，
大体可分为点植法和划线法两种。①点植法：
适用于皮屑、
甲屑、
毛发、
痂皮、组织等有形固体标本，将标 本直接与培养基表面点状接触。②划线法：适用于痰、分
泌物、脓液、组织液、组织块的研磨液等液体标 本，用接种针（环）划线接种在培养基表面。

培养方法有多种，接临床标本接种时间分为直接 培养法和间接培养法；按培养方法分为试管
法、平皿法（大培养）和玻片法（小培养）。①直接培养：采 集标本后直接接种于培养基上。
②间接培养：采集标本后，暂保存，以后集中接种。③试管培养：是临床 上最常用的培养方
法之一，培养基置于试管中，主要用于临床标本分离的初代培养和菌种保存。④大培养 ：将
培养物接种在培养皿或特别的培养瓶内，主要用于纯菌种的培养和研究。⑤小培养：主要用
于菌种鉴定，大致分为三种：玻片法，方块法和钢圈法。
A.
玻片法：在消毒的载玻片上，均< br>匀地浇上熔化的培养基，不宜太厚。凝固后接种待鉴定菌株，置于平皿中，保湿。待有生长
后，盖 上消毒的盖玻片，显微镜下直接观察，常用米粉吐温琼脂培养基观察白念珠菌的顶端
厚壁孢子和假菌丝。
B.
方块法：适用于霉菌菌落的培养。取无菌平皿倒入约
15ml
熔化的培< br>养基，待凝固后用无菌小铲或接种刀划成
1cm2
大小的小块。取一小块移在无菌载玻片 上，
然后在小块上方四边的中点接种待鉴定菌株，盖上消毒的盖玻片，放入无菌平皿中的
V形玻
棒上，底部铺上无菌滤纸，并加入少量无菌蒸馏水，孵育，待菌落生长后直接将载玻片置显微镜下观察。
C.
钢圈法：先将固体石蜡加热熔化，取直径约
2cm
，厚 度约
0.5cm
有孔口的不
锈钢小钢圈，火焰消毒后趁热浸入石蜡油，旋即取出冷却， 石蜡油即附着于小钢圈中。再取
一无菌载玻片，火焰上稍加热，将小钢圈平置其上，孔口向上。小钢圈上 石蜡油遇载玻片的
热即熔化后凝固，钢圈就会固定在载玻片上。用无菌注射器经孔口注入熔化的培养基， 培养
基量约占小钢圈容量的
1/2
，注意避免气泡。待培养基凝固后取一消毒盖玻片， 火焰上加热
后，趁热盖在小钢圈表面，也即固定其上。最后用接种针伸入孔口进行接种。这种方法的优< br>点是形成一种封闭式培养，在显微镜下直接观察菌落时可避免孢子吸入人体，而且不易被污
染，盖 玻片也可取下染色后封固制片保存。

（三）




培养检查

标本接种后，每周至少检查
2
次，观察以下指标：①菌落 外观：
A.
生长速度：缓慢生长菌：
7
～
14d
，快速生长 菌：
2
～
7d
。一般浅部真菌超过
2
周深部真菌超过
4
周仍无生长，可报告
阴性。
B.
外观：
a.
扁平。b.
疣状。
c.
折叠规则或不规则。
d.
缠结或垫状。
e.
其他。
C.
大小：
菌落大小用
cm
来表示，菌落大小与 生长速度和培养时间有关。
D.
质地：
a.
平滑状。
b.
粉 状。
c.
粒状。
d.
棉花状。
e.
粗毛状。
f.< br>皮革状。
g.
粘液状。
h.
膜状。
E.
顔色：不同的 菌种表现出
不同的顔色，呈鲜艳或暗淡。致病性真菌的顔色多较淡，呈白色或淡黄色，而且其培养基也< br>可变色，如马尔尼菲青霉等，有些真菌菌落不但正面有顔色，其背面也有深浅不同的顔色。
菌落的 顔色与培养基的种类、培养温度、培养时间、移种代数等因素有关。所以，菌落的顔