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实验五
细菌鉴定中常见的生理生化反应
一、实验目的。
1)
了解细菌生理生化反应原理,掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。
2)
了解不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况。
3)
了解细菌在不同培养基的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。
二、实验原理。
各种细菌所具有的酶系统不尽相同,
对营养基质的分解能力 也不一样,
因而代谢产物存
在差别。
以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的 代谢作用及其代谢产物,
从而鉴
别细菌的种属,称之为细菌的生理生化反应。
1.
糖(醇)类发酵试验
不同的细菌含有发酵不同的糖(醇)的 酶,因而发酵糖(醇)的能力各不相同,产生的
代谢产物也不同:有的产酸产气,有的产酸不产气。指示 剂溴甲酚紫,
pH5.2
黄色—
pH6.8
紫色,当发酵产酸时,培养基将由 紫变黄。产气可由杜氏小管中有无气泡来证明。
2.
甲基红试验(
M.R
试验)
甲基红试验,
pH4.4红色~
pH6.2
黄色,是用来检测由葡萄糖产生的有机酸,如甲酸、
乙酸、乳酸等。
有些细菌分解糖类产生丙酮酸,
丙酮酸进一步反应形成甲酸、
乙酸、乳酸等,
使培养基的
pH
降低到
4.2
以下。有些细菌在培养的 早期产生有机酸,但在后期将有有机酸
转化为非酸性末端产物,如乙醇、丙酮酸等,使
pH升至大约
6
。
3.
Voges- Proskauer
试验(伏
-
普试验,
V.P.
试验)
伏
-
普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。某些细
菌分解葡萄糖成丙酮酸,
再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。
乙酰甲基甲醇在碱性条 件下,
被氧化为二乙酰,二乙酰与培养基中所含的胍基作用,生成红色化合物为
V.P.
反应阳性。
4.
靛基质试验
某些细菌,如大肠杆菌 ,能产生色氨酸酶,分解蛋白胨中的色氨酸,产生靛基质,靛基
质与对二甲基氨基苯甲酸结合,形成玫瑰 色靛基质。
5.
硫化氢试验
某些细菌能分解含硫的氨 基酸,
产生硫化氢,
硫化氢与培养基中的铁盐反应,
形成黑色
的硫化铁沉淀, 为硫化氢试验阳性。
6.
明胶液化实验
明胶在
25
度以下可维持凝胶状态,以固体状态存在,而在
25
度以上时明胶就会液化。< br>有些微生物可产生一种成为明胶酶的胞外酶,水解这种蛋白质,而使明胶液化,甚至在
4
度仍能保持液化状态。
7.
柠檬酸盐利用试验
有的细 菌如产气杆菌,
能利用柠檬酸钠为碳源,
因此能在柠檬酸盐培养基上生长,
并分
解柠檬酸盐后产生碳酸盐,使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂
pH6.0(黄
)
~
7.6(
蓝
)
,由绿色变为深蓝色。
8.
淀粉水解实验
细菌水解淀粉的过程可以通过底物的变化来证明,即用碘测定不再产生蓝色。
三、实验仪器、材料和用具
实验仪器:
32
度恒温培养箱、
4
度冰箱;
微生物材料:大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌、待鉴定的未知菌的平板单菌
落;
试剂:甲基红试剂、
V.P.
试剂、吲哚试剂,
KOH溶液;
实验用具:
试管:每个试验
3
根试验管,< br>1
根对照管,
8
个试验,共
32
管;
杜氏小管、接种环、接种针、酒精灯、火柴、试管架、记号笔。
四、实验步骤
。
1.
配制培养基(上次实验完成)
2.
鉴别实验
1
)
.糖
(
醇
)
类发酵试验
编号:在各试管上分别标明发酵培养基名称,所接种的菌名和组号,下同。
接种:< br>取葡萄糖发酵培养基
3
支,
按编号
1
支接种大肠杆菌,
另
1
支接种普通变形杆菌,
第
3
支不接种,作为对照。同样取3
支乳糖发酵培养基,
1
支接种大肠杆菌,
1
支接种普通
变形杆菌,第
3
支不接种,作为对照。
将已接种好的培养基置
32
℃温箱中培养
24h
。
2
)
.
甲基红试验
(M.R.
试验
)
将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中,
32
℃培养
2 4h
,
加甲基红
指示剂数滴,观察结果,呈现红色者为阳性,呈现黄色者为阴性。
3
)
.
伏一普试验
(V
.
P
.试验
)
将被检菌 接种到葡萄糖蛋白胨水中,
32
℃培养
24h
,取出,加入
40%
KOH
7
滴,然后再
加入等量的
5
%
a-
萘酚溶液,用力振荡,再放入
37℃温箱中保温
30min
,以加快反应速度 。
若培养物呈现红色,为伏—普反应阳性。
4)
.靛基质
(
吲哚
)
试验
< br>将被检菌接种到胰蛋白胨水培养基中,
32
℃培养
24h
后,
滴加数滴吲哚试剂于培养
物液面,轻轻摇动,观察结果。
出现红色者为阳性,出现黄色者为阴性。
5).
硫化氢试验:
将大肠杆菌和变形杆菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中,
32
℃培养
24h
,观察结果,若有黑色出现者为阳性。
6)
明胶液化试验
取大肠杆菌和枯草杆菌的纯培养物少许 ,
以接种针分别穿刺接种到营养明胶培养基
中,置
32
℃培养
24< br>小时。故观察结果时,应将明胶培养基轻轻放入
4℃冰箱
30min
,此时明胶又凝固。若放置于冰箱
30min
仍不凝固者,说明明胶被试验细菌液化,是为阳性。
7
)
柠檬酸盐利用试验
取少量被检菌接种到 柠檬酸盐培养基上,
32
℃培养
24h
后,
观察结果。
培养 基变深蓝色
者为阳性。
8
)
淀粉水解试验
在培养进表面滴加碘液,观察是否变紫。
五、实验结果及分析
1.
观察结果如下表:
表
1
实验结果
编号
大肠杆
枯
产气
变形杆菌
未知
空白对照
菌
葡萄糖发酵实验
乳糖发酵实验
甲基红试验
伏
-
普试验
吲哚试验
硫化氢试验
明胶液化试验
柠檬酸盐利用试验
淀粉试验
变黄
色,有气泡
变黄
色,有气泡
红色
黄色
玫瑰红
色
黄色
无液体
下蓝上
黄
紫色
草杆菌
/
/
/
/
/
/
/
紫
色
阳性
杆菌
/
/
黄色
红色
玫瑰
红色
/
无液
体
下黄
上蓝
紫色
变黄色,
无气泡
紫色,无
气泡
/
/
黑色从中
间向外蔓延
/
/
黄色
菌
变黄
色,
无气泡
紫色,
无气泡
桔红
色
红色
无色
黄色
液体
下蓝
上黄
紫色
紫色,无
气泡
紫色,无
气泡
淡黄色
淡黄色
淡黄色
黄色
无液体
绿色
紫色
表
2.
各项生理生化实验现象及意义
阴性(对照)
意义
细菌代谢产有机酸
细菌代谢产生气体
细菌代谢产有机酸
细菌代谢产生气体
pH
下降到
4.2
以下
细菌代谢产生乙酰
基甲醇
细菌代谢可分解色
氨酸
细菌代谢产生硫化
氢
细菌可产生明胶酶
细菌可利用柠檬酸
盐作为碳源
细菌可利用淀粉
现象
溶液仍为紫色
杜氏小管中无气体
溶液仍为紫色
杜氏小管中无气体
加入甲基红,
培养基
为黄色
培养基为黄色
培养基为黄色
无黑色固体产生
明胶在
25℃以下不
能液化
培养基仍为绿色
变紫
意义
细菌代谢不产酸
细菌代谢不产生气
体
细菌代谢不产酸
细菌代谢不产生气
体
pH
值大于
6
细菌代谢不产生乙
酰基甲醇
细菌代谢不能分解
色氨酸
细菌代谢不产生硫
化氢
细菌不能产生明胶
酶
细菌不能利用柠檬
酸盐作为碳源
细胞无法利用淀粉
现象
溶液变黄
葡萄糖发酵实验
杜氏小管中有气体
(
>
体积
10%
)
溶液变黄
乳糖发酵实验
杜氏小管中有气体
(
>
体积
10%
)
甲基红试验
伏
-
普试验
吲哚试验
硫化氢试验
明胶液化试验
柠檬酸盐利用试
验
淀粉水解试验
加入甲基红,培养基
呈现红色
培养基呈现红色
培养基呈现红色
产生黑色固体
明胶在
4℃仍能保持
液化状态
培养基由绿色变为深
蓝色
不变,黄色
2.
照片及分析:
1
)
.糖
(
醇
)
类发酵试验
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