常熟中山医院-四川省第五人民医院
一
目的
建立标准菌种确认标准操作规程,
以减少菌种 污染和生长特性的改变,
保证实验结果的可
靠性和准确性。
二
围
本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
三
容
1.1
试验菌株
大肠埃希菌(
Escherichia coli
)
[CMCC(B)44102]
金黄色葡萄球菌(
Staphylococcus aureus
)
[CMCC(B)26003]
枯草芽孢杆菌(
Bacillus subtilis
)
[CMCC(B)63501]
白色念珠菌(
Candida albicans
)
[CMCC(F)64941]
黑曲霉(
Aspergillus niger
)
[CMCC(F)98003]
铜绿假单胞菌(
Pseudomonas aeruginosa
)
[CMCC(B)10104]
生孢梭菌(
Clostridium sporogenes
)
[CMCC(F)98001]
1.1.1
标准菌株
1.1.1.1
标准菌株应来自认可的国或国外菌种收藏机构。
1.1.1.2
标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后,即为标准储备菌株。
DOC
版本
1.1.1.3
标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
1.1.2
工作菌株
1.1.2.1
标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。
1.1.2.2
工作菌株的传代次数应严格控制,不得超过
5
代(从菌种收藏机构获得的标准菌株为第
0
代)
,以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时,应对工作菌 株的纯度和
特性进行确认。
1.2
菌种确认试验的主要容
1.2.1
菌种的纯度确认
1.2.1.1
纯度检测:是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
1.2.1.2
试验容
①
菌落形态:在特定的培养基上,将待检测培养物稀释涂布或平板划 线,适宜培养后,同一平
板上的单菌落的大小、
形状、
颜色、
质地、
光泽等是否相似;
对于两种或以上形态的出发菌株,
应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养, 检测是否重复出现相同特征。
②
镜检特征:对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈 现一致性;细胞形状、大小、荚膜、芽
孢等特征应相似。
1.2.2
菌种的特性确认
1.2.2.1
生化试验:各种微生物具有各自的独特 的酶系统,因而在代过程中所参与的物质分
解和合成代的产物也不同,这些代产物又具有不同的生化特征 。根据此特征,利用生物化学方
法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。
1.3
菌种的确定方法
用无菌接种环粘取培养物,在相应的培养基平板 上划线分离单个菌落,并在适宜条件下培
DOC
版本
养。培养后观察是否具有典型的菌落形态,然后挑取单一纯 菌落,进行革兰氏染色、镜检,观
察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌 种。
1.3.1
大肠埃希菌的确认
1.3.1.1
菌落形态
1.3.1.1.1
取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养 基中,经
35
℃培养
18
~
24h
后,形成菌
膜, 管底有粘液状沉淀,培养物有粪臭味。
1.3.1.1.2
取上述培养物接种于 曙红亚甲蓝琼脂
(EMB)
琼脂平板和麦康凯琼脂平板上,
35
℃培
养
18
~
24h
后,观察结果。
①
曙红亚甲蓝琼 脂
(EMB)
平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色
,
菌落中心 呈深紫
色或无明显暗色中心,圆形,稍凸起,边缘整齐,表面光滑、湿润,常有金属光泽。
< br>②
麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色,菌落中心呈深桃红色,圆形,扁平,边缘整齐,表面光滑,湿润。
1.3.1.2
革兰染色、镜检
1.3.1.2.1
革兰染色
①
以接种环沾取无菌水于洁净载 玻片上,
取菌落形态
(
①
、
②
)
的培养物少许,< br>制成均匀涂片,
自然或微温,再通过火焰
2
~
3
次干燥使固定 。
②
滴加结晶紫染液,染色
1min
,水洗。
③
滴加碘液,媒染
1min
,水洗,以滤纸吸干余水。
④
滴加
95
﹪乙醇,脱色
20
~
30s
,至流出液无 色,水洗。
⑤
滴加沙黄染液,复染
1min
,待干后,镜检。
1.3.1.2.2
染色结果应是:革兰阳性菌呈蓝紫色:革兰阴性菌呈红色。
DOC
版本
1.3.1.2.3
镜检结果应是:两端钝圆的短小直杆菌,单个或成对,革兰 阴性,无芽孢,多有
鞭毛,以周身鞭毛运动或不运动,许多菌株有荚膜和微荚膜。
1.3.1.3
生化试验
1.3.1.3.1
靛基质试验 (
I
)
:取菌落形态(
①
、
②
)的培养物接种于蛋 白胨水培养基中,培
养
24-48h
,沿管壁加入靛基质试液数滴,轻轻摇动试管,液 面呈玫瑰红色为阳性,呈试剂本色
为阴性。
1.3.1.3.2
甲基红 试验(
M
)
:取菌落形态(
①
、
②
)的培养物接种 于磷酸盐葡萄糖胨水培养
基中,培养
48
±
2h
,于培养液中加入甲 基红指示液
2
~
3
滴(约
1ml
培养液加指示液
1
滴)
,轻
微摇动,立即观察,呈鲜红色或橘红色为阳性,呈黄色为阴性。
1.3.1.3.3
乙酰甲基甲醇生成试验(
V-P
)
:取菌落 形态(
①
、
②
)的培养物接种于磷酸盐葡
萄糖胨水培养基中,
培养
48
±
2h
,
,
于
2ml
培养液中 加入
α
-
萘酚乙醇试液
1ml
,
混匀,
再加
40%
氢氧化钾试液
0.4ml
,充分振摇,在
4h
(通常在30min
)出现红色应判为阳性,无红色反应为
阴性。
1.3.1.3.4
枸橼酸盐利用试验(
C
)
:取菌落形态(< br>①
、
②
)的培养物接种于枸橼酸盐培养基
斜面上,培养
2-4
天,培养基斜面有菌苔生成,培养基由绿色变为蓝色时为阳性,培养基颜色
无改变、无菌苔生长 为阴性。
1.3.1.3.5
乳糖发酵试验:取菌落形态(
①
、
②
)的培养物接种于乳糖发酵管,培养
24-48h
,
观察产酸( 指示剂为酸性品红者为红色:指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色)
,产气(小倒管有
气泡,气泡无 论大小都是产气)
。
1.3.2
金黄色葡萄球菌的确认
1.3.2.1
菌落形态
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版本
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