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发酵工程实验
目
录
发酵罐的结构系统及使用方法
实验一
实验二微生物的诱变育种
乳酸菌的分离及乳酸饮料制
作实验三
实验四
大肠杆菌生长曲线的测定
摇床培养枯草芽孢杆
菌发酵条件的优化
实验五
实验一
发酵罐的结构系统及使用方法
一、实验目的：
1
．了解发酵罐（气升式、搅拌式）的几大系统组成，即空气系统、
蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。
2
．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤
3
．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤
4
．掌握发酵罐各系统的控制操作方法
二、实验原理：
1
．
蒸汽系统：
三路进汽——空气管路、补料管路、罐体
2
．温度系统：
(1)
夹套升温：蒸汽通入夹套。
(2)
夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。
3
．空气系统：
取气口→空压机：往复式油泵获得高脉冲的压缩空气
粗过滤器：
由沙布包裹棉花压实成块状叠加制得，
作用是去除部分细菌及大部
分灰尘
（贮气罐）
：空压机 压缩使气体温度升高，经贮气使气体保温杀菌；压缩空气中有油污、水滴，
且压力不稳，
有一定 的脉冲作用，
会冲翻后面的过滤介质，
贮气后可使油滴重力沉降，
减小脉冲。
（冷却塔）
：有降温并稳定作用，同时经旋风分离器进行气液分离
(
丝网分离器
)
：通过附着作用，逐步累积沉降而分离
5
微米以上的微粒
其作用介质为铜丝网
(
加温器
)
：
对压缩空气升温，除湿，使湿度达
50%
-
60%
总过滤器：纱布包裹棉花加活性炭颗粒，逐层压紧而成。
分过滤器：平板 式纤维，中间为玻璃纤维或丝棉，下面放水阀应适时打开放出油、水，再用压缩
空气控干。
种子罐或发酵罐
4
．补料系统：补培养基、消泡剂、酸碱等。
5
．在线 控制系统：热电偶（温度探关）
、溶氧探头、
pH
探头（后二者实消时才安装，为不可 再
生探头，有限定使用次数，
pH
探头使用前要先校准）
、控制柜、数据采集 系统。
。
)
取样口
(
、出料口)
接种口
(
、进出料系统：进料口
6
．
7
．蒸汽过滤器：在蒸汽进入空气系统时应用，以免蒸汽中携带的杂质颗 粒堵塞分过滤器微孔。
三、方法与步骤：
(
一
)
原则：
1
．
通蒸汽前先关闭所有阀门。
2
．粗过滤器不空消也不实消，要定期处理，所以必须关闭通向粗过滤器的阀门。
3
．活蒸汽，灭过头，即尾汽不能关死，要保证有活蒸汽放出，但不能太大，以免分 压。
4
．罐体排汽口排汽，并保持罐内正压。
5
．空气过滤系统只空消，不实消，以免罐中物料冲入过滤器内。但空消一结束，即要通入无菌空气吹干管路并保压，避免染菌。
6
．进蒸汽时顺着蒸汽管路开阀门 ，结束时逆着进路关阀门，先开尾阀后开主阀，结束时先关主
阀后关尾阀。
8
．蒸汽一停，即由无菌空气充入保持罐内正压。
（二）空消：
先开启蒸汽发生器，自有蒸汽产生并排掉管路中冷凝水后，按以下步骤进行：
1
．先关闭所有阀门，检查处是否关紧密封，打开罐上方排气口。
2
．蒸汽先进空气系统，蒸汽→蒸汽过滤器→分过滤器，无论蒸汽走到哪一路得先放尾阀，放出
冷凝水，排掉冷空气，待有蒸汽冲出后调小，打开主阀。
3
．再进罐体：由主路进罐，然后通入取料管路，再入补料系统（两边）
。
4
．
罐压升至
0.12Mpa(
此时控制系统中温度读数 约为
120
℃左右
)
时开始计时，
保温保压，
30
分钟。
保压方式：
（
1
）调节主汽路进汽阀门控制进汽 量；
（
2
）调节排气口排气量大小或尾阀放汽量。
5< br>．结束空消：
（
1
）逆着蒸汽进路关，先关近罐阀。
（
2）同时准备好压缩空气确保蒸汽一停即充
入无菌压缩空气以维持空气系统及罐内的正压。近罐空气阀 的尾阀要一直微开启。
注意：空消前应检查夹套中是否残留了冷水，若有，影响罐体升温，须自夹套出水口将水放出。
（三）进料及升温
1
、调大排气口排气量，至罐压掉 零，开启进料口，加料。装上溶氧探头及
pH
探头。
2
．夹套升温：
蒸汽由夹套蒸汽管路进入夹套进行升温（有表压 可读出进入夹套的气压）
，温度可由控制面板上
读出，升至
90
℃，关闭夹套 蒸汽。
*
升温目的：冷的物料和罐体中直接冲入蒸汽，极易产生大量冷凝 水而使培养基中水分过大；另
外，对淀粉质的物料，则直接通入蒸汽很容易使物料结球不溶，表面糊化结 团，影响灭菌效果；
升温还可以利于淀粉质原料液化。
*
说明：
(1)
培养基配制时，考虑实消时会产生水分，因此，若考虑用
7
升的装液量
(10
。
70%
升
需量称量。装料系数一般为
7
升左右，其余物料按
6
，则加液量应为
)
升罐．
（
2
）通蒸汽对夹套升温时，必须排空夹套内水
(
可用蒸 汽冲出
)
，但可微开启出水口阀门适当减
压，避免夹套内压力过大。
(
四
)
实消：
1．关闭气路入罐阀，主汽路进汽→补料口进汽（方法同空消）→罐压升至
0.12Mpa
（
121
℃）
，
保压、保温
30
分钟→实消结束。
（五）冷却接种：
蒸汽关闭的同时，即通入压缩空气（罐压表 头掉至
0.05MPa
时接入无菌空气）→夹套通入自来
水冷却（下进水，上出水阀门 ，送水排水）→冷却至约
32
℃→接种（放大排气口出气量，至表
头掉零，开启接种口 ，火圈接种）→接种后拧紧接种口，将排气阀调小，接上玻璃转子流量计，
使流量计读数在
8. 0
左右，同时保持罐压
0.06Mpa
→在控制系统中设定好发酵温度→保温保压发< br>酵
24hr
（六）数据采集、取样、放罐
数 据采集：系统自动采集，每
2
分钟采集一组数据并存贮，包括：温度、溶氧、
pH、等，系统
可自动给出有关曲线。同时由值班者每
20
分钟记录一次，准确填表， 获取数据制作过程曲线。
中间取样：每取样前，将取样口蒸汽灭菌半小时→弃去始 放出的样液约
10
毫升，再用无菌空容
器取样约
100
毫升→无菌封 存→取样口再灭菌
30
分钟→样液冷藏待测。
(
具体步骤见电脑桌面文
件
)
放罐：调节无菌空气量放罐，方法同取样。
(
七
)
罐体清洗
放罐后，
加大排气 ，
使表压掉零，
取出各探头，
加盖，
由进料口加入净水关好，
罐内升 压，
放罐，
如此重复两次。
*
实验二
紫外线诱变育种
一．目的要求
通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，学习微生物诱变育种的基本方法。
二．基本原理
由于微生物自发突变率一般很低，为了提高突变 频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变，
紫外线是目前使用最方便且十分有效的物理诱变剂之一。
紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是
DNA
的分子结构发生 改变（同链
DNA
的相邻嘧啶间
形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体）
，从而引起 菌体遗传性变异。
三．菌种与仪器．
菌种：枯草芽孢杆菌；
培养基：
仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（
15W
）
，电磁搅拌器，离心机
、培养皿、三角瓶、涂
布棒等
四．操作步骤
（
1
）菌悬液的制备
（
a
）取培养< br>48
小时的枯草芽孢杆菌的斜面
4
—
5
支，用无菌生理盐水将 菌苔洗下，并倒
入盛有
玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡
30
分钟，以打碎菌块。
（
b
）将上述菌液离心（
3000r/min
，离心
15
分钟）
，弃去上清液，将菌体用无菌生理盐
水洗涤
2—
3
次，最后制成菌悬液。
8
个。
）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升
10
（
c
（
2
）平板制作将淀粉琼脂培
养基溶化后，冷至
55
℃左右时倒平板，凝固后待 用。
（
3
）紫外线处理
（
a
）将紫外线灯开关打开预热约
20
分钟。
（
b
）取直径
6cm
无菌平皿
2
套， 分别加入上述菌悬液
5ml
，并放入无菌搅拌棒于平皿中。
（
c
）将盛有菌悬液的
2
平皿置于磁力搅拌器上，在距离为
30cm
，功率为
15W
的紫外线灯下
分别搅拌照射
1
分钟 及
3
分钟。
-
1
-
6
（具体 可
10
-
10
将上述经诱变处理的菌悬液以
(4)
稀释在红灯下，
10
倍稀释法稀释成
三个稀释度涂平板，每个稀 释度涂平板
310
只，每只平板加
、
10
(5)
涂平板取
10
、稀释菌
按估计的存活率进行稀释）
。
-
4
-
5
-
6
液
0.1ml
，用 无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。
(6)
培养
将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37
℃培养
48
小时。注意每个平皿背面要标明处
理时间和稀释度。
(7)
计数将培养
48
小时后的平板取出进行 细菌计数，
根据对照平板上菌落数，
计算出每毫升菌
液中的活菌数。同样计算出紫外线 处理
1
分钟、
3
分钟后的存活细胞数及其致死率。
(8)
观察诱变效应
将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5
—
6
个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透
明圈。分别测量 透明圈直径与菌落直径并计算其比值（
HC
值）
。与对照平板进行比较，根据结
果，说明诱变效应。并选取
HC
比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜
面可作复 筛用。
五．实验结果
1
．结果
将实验结果填入下表。
．
稀释倍数
平均菌落
-
4
-
5
-
6
存活率
%
致死率
10%
1010
处理时间
（数
/
皿）
诱变剂
min
）
（对照紫外
1U3
比透明圈和菌落直径大小（㎜）及
H
652314
HHHHHH
处理处
UV
理
对照
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