低回声DEAE sephadex A50

2021年1月30日发(作者：宫颈粘液少)
DEAE-Sephadex A-50
柱层析纯化免疫球蛋白

撰稿

欧阳笑梅


















原理

试剂和器材

操作步骤

注意事项



(
一
)
原理

-


DEAE-SephadexA-50(
二乙基氨基乙基-
葡聚糖
A
-50)
为弱碱性阴离子交换剂。
用
NaO H
将
CL
-
型转变为
OH
型后，
可吸附酸性蛋白。
血清中的
γ
球蛋白属于中性蛋白
(
等电点为
PH6.85< br>～
7.5)
，
其余均属酸性蛋白。在
PH7.2
～
7 .4
的环境中，酸性蛋白均被
DEAE-Sephadex A-50
吸附，只有γ
球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析
γ
球蛋白便可在洗脱中先流出
,< br>而其他蛋白则被吸附在
柱上
,
从而便可分离获得纯化的
IgG
。
DEAE-sephadexA-50
柱层析是离子交换层析的一种。



(
二
)
试剂和器材



1
、试剂
:



(1)
盐析提取的人
γ
球蛋白；



(2)0.5N NaOH
，
0.5N HCl 2M NaCl
，
10
％
NaN3
；



(3)DEAE-Sephadex A-50
，聚乙二醇
(PEG)
；



(4)0.1M, PH7.4 PB(
配制见盐析部分
)
；



2
、器材
:



(1)< br>层析玻璃柱(1.3×40cm)，滴定铁架，自由夹，螺旋夹，尼龙纱
(200
目)
；



(2)
普通冰箱，
751
桮型紫外分光光度计，电导仪、抽滤装置
(
包括抽气机、干燥瓶、布氏漏
斗、橡皮垫圈 、抽滤瓶
)
，
PH
计；



(3)
透析袋、座标纸、滤纸、
PH
精密试纸；



(4)
量筒、烧杯、试管、吸管、滴管、灭菌小瓶等。



(
三
)
操作步骤



1
、
DEAE-Sephadex A-50
预处理



称
DEAE-Sephadex
A-50(
下称
A-5 0)5
克，悬于
500ml
蒸馏水，
1
小时后倾去上层细粒。按每< br>克
A-50
加
0.5N
NaOH
15ml
的比例，将
A-50
浸泡于
0.5N
NaOH< br>中，搅匀，静置
30
分钟，装入布
氏漏斗
(
垫有
2< br>层滤纸
)
中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至
PH
呈中性；再以
0 .5N
HCl
同上操作过程
处理，最后以
0.5N NaOH
再处 理一次。处理完后，将
A-50
浸泡于
0.1M
，
PH 7.4 PB
中过夜。



2
、装柱



(1)
将层析柱垂直固定于滴定铁架上，柱底垫一园尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料 管并关闭
开关。



(2)
将
0.1M
，
PH7.4
PB
沿玻璃棒倒 入柱中至
1/4
高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成
稀糊状的
A-50
。
待
A-50
凝胶沉降
2-3cm
厚时，
启开出水 口螺旋夹，控制流速
1ml/
分钟，同时连
续倒入糊状
A-50
凝胶 至所需高度。



(3)
关闭出水口，待
A-50
凝胶完全沉降后，柱面放一园形滤纸片，
以橡皮塞塞紧柱上口，
通
过插入橡皮塞之针 头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。



3
、平衡:
启开出水口螺旋夹，控制流速
12-14
滴
/
分钟，使约2
倍床体积的洗脱液流出。并
以
PH
计与电导仪分别测定洗脱液及流出液 之
PH
值与离子强度是否相同。
达到一致时关闭出水口，
停止平衡。



4
、加样及洗脱
:



启 开上口橡皮塞及下口螺旋夹，
使柱中液体缓慢滴出，
当柱面液体与柱面相切时，
立即关 闭
出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品
(
体积应
<
床体积的
2
％，蛋白浓度以
<100mg
为宜
)
。松开出
水口螺旋夹 使柱面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁
2-3
次；再 放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数
ml
洗脱液，紧塞柱上口，
使 整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速
12
～
14
滴／分钟。



5.
收集：开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集
3< br>～
5ml
。共收集
10
～
15
管。



6.
测蛋白：以
751-G
型紫外分光光度计分别测 定每管
OD280nm
，与
OD260nm
，按前述公式
计算各管蛋 白含量。并以
OD280nm
为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。



7.
合并、浓缩：将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并 ，以
PEG(MW6000)
洗
缩至所需体积，加入
0.02
％NaN
３防腐剂，于
4℃保存备用。



8.
A-50
凝胶的再生
:
在柱上先以
2M
NaCl
洗柱上的杂蛋白至流出液的
OD280nm<0.02
，
再以
蒸馏水洗去柱中 盐。然后按预处理过程将
A-50
再处理一遍即达再生。近期用时泡于洗脱缓冲液
中４ ℃保存；近期不用时，以无水酒精洗
2
次，再置
50℃温箱烘干，装瓶内保存。



(
四
)
注意事项



1.
柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，
就得获得理想的分辨率，但由于层析柱 流速同
压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使液体流动的不均< br>匀性增加，分辨率明显下降。