基础代谢率减肥法造血干细胞分离培养方法

2021年1月30日发(作者：保妥适瘦脸多少钱)
一

造血干细胞分离

（一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备

1 HES(
羟乙基淀粉
)
沉淀法


抽取髓液
500 m L
按
4
∶
1
比例加入
HES
，自然沉降红细胞后，分离上清。
4
℃
400 g
离心
10 min
得细胞沉淀物，以
1 %
白蛋白盐水液洗涤细胞
2
次。

2 percoll
液密度梯度离心法


①按体积比为～
2)< br>∶
1
在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。
4
℃
,1 5 00 r / min
，离心
20 min
。取
单个核细胞层，以
1%白蛋白盐水液洗涤
3
次。


②取鼠股骨和胫骨
,
在两头关节处切开骨骼
,
反复用培养基冲洗骨髓腔
,
随后小心地逐滴将
细胞悬液加在淋巴细胞分离液上
, 2 000 r / min
离心
20 min
。吸取离心后相交液面处的白色细胞
层即为单个核细胞。

3 Ficoll
分离法

方法一

在
15ml
分离管 中加比重为的
Ficoll
液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温
离心2000r/min
×
20min,
吸取白细胞层，
用
RPMI 1640
液亲清洗后离心
2000r/min
×
10min,
取白细 胞层
加
RPMI1640
液到
10ml
制成造血干细胞悬液样本。< br>
方法二

取无菌离心管
1
支，
预先添加
3 mlFicoll(
与骨髓细胞悬液体积
1:1)
，
用滴管取单细胞悬
液
3ml
，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心< br>2000rpm
×
20
分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心 吸取单个核细胞，置入另一短中管中，
加入
5
倍以上体积的磷酸缓冲液
PBS
，
1500rpm
×
10
分钟，
L-DMEM
洗涤 细胞两次，每次以
1000r/min
离心
10min
，去上清液。（除第一 步的室温离心外，其余为低温离心）。

取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能 剔除，并用
PBS
缓冲液冲洗干净。在超
净台中腿骨浸泡在
PBS
缓 冲液中
5min
，
之后在两头关节处切开骨骼
,
反复用
PBS
缓冲液冲洗骨髓腔，
从而得到骨髓细胞悬液。

（二）
Linc-- kit+
造血干细胞的分离纯化。

去除
Lin
细胞
(
负筛选
) :
带有生物素的混合抗体标记成熟细胞

抗生物素的磁珠吸附抗体标
记的成熟细胞
,
包括
T , B
淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞

细胞通过磁
场 不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集
CD117
细胞
(
正筛选
)
：带有
CD117
抗体
的磁珠吸附
CD117细胞
,
细胞通过磁场被柱子吸附的
CD117
细胞
(
具体操作步骤参照
M
iltenyi
公司
MACS
手册
)
。

（三）根据细胞表面
CD34
抗原进行分离纯化


流式细胞仪检测骨髓
CD34
细胞：取
50
μ
L
细胞悬液< br> ,
加入μ
L CD45- FITC
和
10
μ
L CD34- PE
充分混合
,
避光孵育
15 min
。以
PBS
液洗涤并加多聚甲醛固定液
450
μ
L
固定
,
上机检测。


磁性标记
CD34
细胞：在细胞悬液中加入
100
μ
L Fc - R
阻滞剂
,
再加入
100
μ
LCD34
磁珠标记
细胞
,
于
4
℃冰箱中充分混合孵育
30 min
。用
PBS
缓冲液洗涤细胞，离心
10 min ,
去上清液后再
以
500
μ
L PBS
缓冲液重新悬浮细胞。

MiniMACS
磁性分离、纯化
C D34
细胞：将
MS
分离柱放置在
MACS
分离器的磁场中，以500
μ
L
PBS
缓冲液漂洗。
以孔径
30
μ
m
的尼龙网或过滤器去除细胞悬液凝块
,
细胞通过分离柱
,
以
500
μ
L
PBS
+
+
+
+
+
+
+
+